3.3.2 离子交换层析（下）在线视频

设计离子交换层析实验时

首先需要知道的

就是目的蛋白的pI

由于蛋白质分子的pI

是由其含有的所有氨基酸侧链所决定的

而目的蛋白的氨基酸序列通常是已知的

所以

人们便可以通过

亨德森 哈塞尔巴尔赫方程

等方法推算出目的蛋白质的理论pI

在这里

介绍三种常用的在线工具

可以用于快捷地获得目的蛋白质的理论pI

第一个是ProtParam

由ExPASy网站

著名的生物信息学资源门户提供

这是大多数生命科学工作者

所知道的“经典”工具

可以根据氨基酸序列

计算蛋白质的分子量 pI 消光系数等参数

第二个是Isoeletric Point Calculator

这个工具的特点是

使用多种算法和解离常数

数据库来计算蛋白质分子的pI

而且可以同时计算多个蛋白质分子的pI

和其它理化参数

第三个是ProMoST

翻译后修饰

对蛋白质分子的pI具有显著影响

翻译后修饰简称PTM

大多数PTM发生在可电离的侧链上

而且一些PTM 磷酸化 乙酰化

会引入新的可电离的化学基团

从而影响蛋白质的pI

对于可能含有PTM的真核生物蛋白

推荐使用ProMoST

这个网站来计算

和比较PTM对pI 分子量和其它理化性质的影响

下面我们来看

如何确定最优的缓冲液条件

首先讲一下pH

图中的蓝绿红三条曲线

分别对应三种不同蛋白的滴定曲线

可以看到蓝色蛋白的pI最低

红色蛋白的pI最高

我们来看一下

这三种蛋白

在弱酸和弱碱的情况下的表面电荷情况

以及在用阴离子交换剂纯化时的表现

首先看左边

在弱酸pH条件下

蓝色蛋白由于pI小于溶液的pH

所以带负电

而红色和绿色蛋白

由于pI大于pH

则带正电

因此

蓝色蛋白可以与阴离子交换剂结合

而红色和绿色蛋白则无法结合

也就是会直接穿透填料

而先于蓝色蛋白被洗脱下来

我们再来看右边

在弱碱pH条件下

蓝色和绿色蛋白的pI都小于pH

所以都带负电

而红色蛋白由于pI最大

仍然大于pH

所以还是带正电

因此

蓝色和绿色蛋白

可以与阴离子交换剂结合

而红色蛋白仍然无法与阴离子交换剂结合

可见

在弱酸pH条件下带正电的绿色蛋白

在弱碱pH条件下则是带负电的

会由于pH的变化而在纯化过程中

有着全然不同的表现

所以

选择合适的pH

对于设计缓冲液来说是非常关键的

除了pH之外

设计缓冲液时

需要考虑的另一个重要因素是缓冲体系

需要根据所使用的离子交换剂

来进行设计

以使用阴离子交换填料为例

在这种情况下

缓冲液需要使用阳离子型缓冲体系

这样填料和缓冲液的组分

都带有相同的电荷

也就是正电

可以避免相互作用

缓冲液的pH

需要高于目的蛋白的pI

一般在0.5到1个pH单位

以保证目的蛋白带有负电

从而能够被阴离子交换填料所捕获

适当增加pH

将提高目的蛋白的电负性

有助于增加和阴离子交换填料结合的强度

如果选用阳离子交换填料的话

可以使用右下角的图示

来选择缓冲液组分

一般而言

缓冲液的pH

通常会与生理pH比较接近

也就是在7-8这个范围内

我在右边的两张图示中用浅红色背景进行了标注

可以看到

实验室常用的Tris MES phosphate和HEPES等缓冲液

配制试剂的工作

都在这个区间内

此外

缓冲液的浓度一般在20-50个毫摩

还有

也要注意缓冲液的pH

和其缓冲组分pKa值的差异

尽量不要超过0.5个pH单位

此外

还有几点注意事项

一是pH和离子强度

由于纯化得到的蛋白

需要维持生理活性

所以缓冲液的pH

和离子强度必须确保

可以同目的蛋白的稳定性和活性相兼容

最适合的pH

应该允许目的蛋白结合在填料上

但又尽可能地接近蛋白

被洗脱下来的pH值

如果该pH值太高或太低

蛋白与填料结合得过于紧密

洗脱将会变得更加困难

而需要更高的盐离子浓度

这种情况是需要尽量避免的

因为一些蛋白在高盐离子浓度条件下会沉淀

而很高的盐离子浓度

也可能干扰后续的其它试验或色谱分离过程

二是添加剂

有时

为了保证目的蛋白的活性

在纯化过程中尽可能稳定

有时需要在缓冲液中加入添加剂

不同的添加剂

可能会带来各种潜在的问题

例如

添加甘油和醇类

会导致粘度和背压增加

从而增加层析所需花费的时间

阴离子去垢剂如SDS

会结合在阴离子交换树脂上

阳离子去垢剂如CPC

会结合在阳离子交换树脂上

从而降低分离的效果

所以

第一次使用新的去垢剂时

应先运行空白对照实验

也就是要比较

添加去垢剂前后对纯化效果的影响

一般而言

如果是不带电荷的中性添加剂

通常是不会对纯化效果有明显的影响的

三是起始缓冲液条件

有些时候

由于理论pI可能与蛋白的实际pI有较大差异

或者是要纯化带电性质未知的样品时

可以借鉴使用下面的缓冲液配方

可以看到

使用阴离子交换体系时

缓冲液的pH一般为弱碱性

而使用阳离子交换体系的时候

一般选择弱酸性的缓冲液

在考虑完蛋白质和缓冲液后

我们来看一下填料的选择

对纯化效果所带来的影响

上方表格中列出了常见的功能基团

正是这些基团

保证了填料能够在工作pH的范围内

带有稳定的正电荷或者负电荷

从而得以捕获带有相反电荷的目的蛋白质分子

这里的一个重要概念是填料的“强”和“弱”

要注意的是

这里的“强”和“弱”

是指功能基团的离子化状态

随着pH值的改变而改变的程度

而不是功能基团同蛋白质分子结合能力的强弱

比方说

强离子交换填料在pH发生改变时

离子交换能力不变

也就是说这些离子交换填料

并不会随着pH的改变

而获得或者丢失质子

在一个pH变化较大的情况下

也不会轻易获得或者丢失质子

从而得以保持其所具有的正电性或负电性

而弱离子交换填料

则不具有这个能力

会随着pH的改变

而获得或丢失质子

因而它们的离子交换能力

将随着pH的改变而变化

所以

在纯化蛋白时

一般首选的是强离子交换填料

在选择性不够好的情况下

可以尝试使用弱离子交换填料

除了功能基团之外

填料的粒径大小也对纯化的效率有影响

左上方的表格里是常用的填料的材料和粒径

右侧则是不同粒径的填料

在纯化相同蛋白样品时的结果

可以看到分辨率

可以通过减小填料的粒径来提高

也就是说

选用粒径小的填料

有助于获得更好的分离效果

尽管如此

粒径的减小也会增加系统的背景压力

需要减小流速

从而增加了分离运行时间

因此

在具体选择时

需要综合考虑流速 分辨率 纯度等多个因素

并将填料与所需的纯化过程相匹配

而不是每次都盲目地选择粒径小的填料

下面来说一下蛋白样品准备的要求

一是体积

离子交换层析

对于样品体积的要求其实并不严格

所以小体积样品

建议先用起始缓冲液

进行稀释后再上样

而大体积的样品可以直接上样

二是调整样品缓冲液

由于较高的盐浓度

会影响样品与填料的结合

所以有时在实验前

需要调整样品缓冲液的盐浓度和pH

使之与结合缓冲液的盐浓度和pH

尽量保持一致

这对于获得高效的最佳分辨率

分组分离

以及充分发挥填料的结合能力

至关重要

三是净化

对样品进行净化的目的

是要移除杂质颗粒

防止堵塞层析柱

尤其是填料的粒径大小

在34 μm左右或更小时

对于小体积的样品

可用与注射器连接的醋酸纤维素滤膜

或者PVDF滤膜来进行过滤

这样样品损失比较小

对于大体积的样品

则可以使用离心来去除不溶的杂质颗粒

丢弃沉淀

保留上清即可

此外

洗脱方式对于分离效果也具有明显的影响

我们来看一下梯度洗脱

和分歩洗脱这两个方法

对于第一次纯化不确定其带电性质的样品时

常用的方法是梯度洗脱

一个典型的梯度洗脱实验结果如左上图所示

优点是分辨率较高

但谱峰一般也会比较宽

相对而言

分步洗脱具有峰窄 浓度高

硬件要求低 工艺稳定 选择性好等优点

但一般需要先进行预实验

其实就是梯度洗脱来摸索实验条件

确定分步洗脱的具体盐浓度

所以

在建立纯化方法的时候

一般先采用梯度洗脱

在进行更大规模的分离纯化实验

且已经进行了预实验时

则可以考虑使用分步洗脱

除了洗脱方式外

梯度洗脱的具体设置

也会影响分离效果

通过比较左侧和右侧的两种情况

可以清楚地看到洗脱梯度越长

分辨率越高

当然

如前所述

这也会带来

峰宽增加和增加层析实验时长的问题

离子交换层析的最后步骤

是填料的清洗 再生和保存

首先是清洗

通常使用高盐溶液

1 M

去除结合的比较紧的杂质

这个过程也叫高盐洗脱

然后用5个柱体积的缓冲液进行再平衡

重要的是每次实验后都需要清洗

已保证填料不会因为积累杂质分子

而影响分离效果

然后是再生

大多数的离子交换填料

可以用 1 M的NaOH 清洗

以彻底去除杂质

中性去污剂和酶也可以用于进行去除杂质

30%异丙醇

则可用于清洗脂类杂质

最后是保存

清洗和再生后的离子交换填料

可保存在20%的乙醇溶液中

这样可以避免微生物的生长

下面我们来

我们来举几个离子交换层析的应用实例

一是在实验室规模的级别上

纯化TniA转座酶

一种碱性DNA结合蛋白

可以看到

在纯化过程中有两步都使用了离子交换

分别是用于快速去除蛋白酶和最后精细纯化

二是在工业规模级别上

纯化蛋白质酪氨酸磷酸酶1B

可以看到

在纯化过程中也有两步都使用了离子交换

通过精细纯化步骤

获得了大于百分之九十的纯度

和优于百分之六十的产率

最后的例子

是关于真核生物RNA聚合酶的发现

真核转录研究领域的先驱之一

目前在美国洛克菲勒大学任教的

Robert G.Roeder教授

在50年前发现三种

真核生物RNA聚合酶 I II III时

正是使用了离子交换层析的方法

他先是用高浓度盐溶液

处理海胆胚胎的细胞核

使得细胞核破裂

及组蛋白解聚

紧接着

利用超声波将DNA打碎

同时释放结合在DNA上的RNA聚合酶

最后用低浓度盐溶液快速稀释样品

使组蛋白选择性地沉淀掉

通过这个方法得到的上清液

就含有可溶的RNA聚合酶

然后

他将上述上清液

上样到 DEAE Sephadex

阴离子交换柱

再用硫酸铵溶液进行梯度洗脱

获得洗脱样品

最后

检测了洗脱样品中的酶活

发现了三种不同的RNA聚合酶的活性

如左图中的I II III对应的三个峰所示

最后

为大家进行一下离子交换层析这部分的小结

通过前面的内容

可以看到离子交换层析的优点是

可控性好 高载量 高效率 有浓缩效应

那么要获得理想纯化结果呢

需要特别关注以下几个要素

1考虑缓冲液的pH 组分 添加剂

选择最适合的组分

根据功能基团和粒径

来选择合适填料

以及合适的洗脱方式

这些都对获得优化的纯化结果非常重要