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大家好我是陈媛媛

来自中国科学院生物物理研究所

我今天给大家讲的是

Biacore实验设计和操作

生物分子的活性功能

是通过分子之间的相互作用来体现的

许多重大生命现象

比如遗传

生长

发育

病变

以及病原体的入侵等

无一不依赖于生物分子之间的相互作用

今天我们就来给大家介绍一种

生物分子之间相互作用的研究技术

Biacore技术

Biacore技术核心部件包括光学系统

传感器芯片

和基于微流控原理的流路系统

它的检测原理

是基于表面等离子共振SPR技术

SPR响应值

与芯片表面分子的质量变化成正比关系

为了研究两个分子之间的相互作用

其中一个分子被固定到芯片表面上

另一个分子以溶液的形式连续流过

如果能和固定分子相互作用

芯片表面质量的增加

可引起SPR信号的增加

当样品被切换成单纯的缓冲液

则解离过程会随之而来

我们会看到SPR信号下降

Biacore具有非标记实时监测的优点

通过实时记录分子结合和解离过程

我们可以得到

生物分子互作的动力学和亲和力

我们先来介绍一下

亲和力和动力学的概念

亲和力一般叫做

平衡解离常数KD

它的单位是摩尔浓度

动力学主要包括两个参数

分子结合的速率ka

它的单位是每摩尔每秒

另一个参数是

分子复合物解离的速率

它单位是每秒

kd除以ka

我们就可以得到

平衡解离常数KD

Biacore实验该如何进行

获得可靠的数据呢

在这之前

我们先介绍两个常用的术语

在Biacore实验中

固定到芯片表面的生物分子

称为配体Ligand

要注意

在这里它与细胞受体配体的概念是不同的

配体可以通过化学偶联试剂

共价地固定于芯片表面

也可以通过捕获的方法

利用高亲和力的结合

固定于一个偶联在芯片表面的捕获分子上

分析物Analyte

是以溶液的形式流过配体的

另一个相互作用的分子

下面我们就来介绍一下

Biacore实验设计和流程

我们将在Biacore T100仪器上

测定两个生物分子

β2-微球蛋白

和一个抗体之间的互作和亲和力

实验中采用的运行缓冲液

是HBS-P buffer

也就是两个分子相互作用的

溶液环境

它是一种常用的缓冲体系

后面我们将采取

理论和上机相结合的方式讲解

实验主要分为四个部分

第一个是配体固定

也叫配体偶联

分析物结合

再生和亲和力和动力学测定

第一步是配体固定

配体是固定在传感器芯片上

商业化的传感芯片有十几种

它们在表面介质上有所不同

以适合不同类型的生物分子的固定

一看这么多芯片种类

我们可能会有些眼花缭乱

无从下手

我们先来了解下

平时实验中最常用的四类芯片吧

CM5芯片

是共价偶联蛋白配体

SA芯片

可以用来捕获生物素标记的配体

如核酸

糖类

肽段和蛋白质等

NTA芯片是捕获His-tag的蛋白配体

Protein A Protein G Protein L芯片

是捕获型抗体类芯片

它们主要用于

抗原抗体的实验

我们需要根据生物分子的性质

选择哪个分子作为配体固定

以及采用哪种固定方式

在这次实验中

我们选择在CM5芯片上

氨基偶联抗体

CM5芯片表面是羧基化葡聚糖

通过EDC NHS试剂

可以活化葡聚糖上的羧基

使其能与蛋白上的氨基发生反应

从而将蛋白固定到芯片上

我们选择将二价抗体作为配体偶联

这样可以防止舞蹈效应

大家看右边这张图

如果将抗原固定到芯片上

由于抗体上有两个抗原结合位点

在解离过程中

即使抗体中有一个结合位点

从抗原上解离

但由于另一个位点

结合了另一个抗原分子

芯片表面的信号不会发生变化

因此舞蹈效应让解离更加缓慢

影响了准确性

在氨基偶联过程中

配体需要通过静电

预富集到芯片表面上来发生反应

这就需要寻找一个合适的偶联缓冲液

一般是不同pH的

10mM NaAc缓冲液

该缓冲液pH值需要大于3.5

小于配体等电点

这样配体可以带有正电荷

而芯片表面是负电荷

中间哪个条件最优

则需要比较配体在不同条件上的反应信号

一般来说

信号最高的是最适合的

在这里

大家要注意的是

预富集pH条件的摸索

是氨基偶联过程之前

在空白芯片上进行的

蛋白不会共价结合到芯片表面

那配体需要固定多少呢

结合实验和预实验时

由于不了解蛋白固定后的

活性损失情况

固定量会高一些

这样可以获得更明确的定性结果

并且方便摸索后续条件

对于动力学分析

为减少物质迁移的限制

和芯片表面分子拥挤

造成的复杂结合

配体的固定量应该保持在较低水平

以使得分析物结合的最大反应值

一般在20-100个RU

这里有一个公式

分析物理论最大反应值Rmax

等于分析物分子量

除以配体分子量

乘以配体固定水平

乘以结合比例

这里要注意

理论的Rmax往往高于实际的Rmax

当然

我们也可以根据

希望得到的最大反应值

倒推需要的固定量

这里举一个例子

我们这次上机实验中的分析物微球蛋白

它的分子量是11.8 kD

配体分子量是150 kD

一个配体可以结合两个分析物

那当固定量为1200 RU时

获得的理论最大反应值是188 RU

接下来我们给大家演示一下仪器的操作

首先我们来介绍一下

我们实验用到仪器

Biacore T100

这个仪器分为几个部分

传感器芯片

样品仓

运行缓冲液放置的位置

清洗用的水

废液缸

还有最关键的光学检测装置

在仪器内部我们暂时看不到

接下来我们就要正式开始

我们的实验

首先我们要

更换我们今天实验所用的芯片和运行缓冲液

在仪器的控制软件

我们先点击这个按钮

Eject sensor chip

等待大约1分15秒后

这边芯片将会弹出

我们要进行更换

好 现在芯片仓的门已经打开

我们把之前的维护芯片拿出来

换上我们今天使用的CM5芯片

同时我们要将这边的缓冲液

更换成为我们今天实验所用的运行缓冲液

点击在命令里输入芯片的ID

还有它的lot no.号

点击Dock

这样我们新的芯片就会放入到仪器内部

芯片放入之后

我们从Tools里面

找到Prime命令点击

这个命令是要用我们的运行缓冲液

将整个仪器系统清洗一遍

点击start

Prime的时间大约是六分半钟

Prime结束以后

我们开始我们实验的第一步固定

我要从软件中选择Run

选择Wizard

固定

Surface Preparation Immobilization

今天我们用第4通道来固定

输入我们要固定的配体的名字

今天我们想做的固定量

是1200 RU

点击Next

Prime勾掉

这里显示的是温度

这里是

Biacore T100上样品架的种类

我们选择Rack 1

这是我们固定里面

需要用到的样品

选择它们的位置

好 下面我们就要准备相应的试剂

试剂准备好之后

我们需要将它放入到

我们仪器里的样品架

点击Eject Rack按钮

样品架将会从仪器里面弹出

用手推一下即可拿出

现在我们需要把我们的样品放到

我们对应的位置

样品准备的体积不能小于

程序里边给定的体积

现在我们的样品已经放置好了

我们需要放入到样品仓里

点击OK

样品架放好之后

我们就要开始这个程序

点击Next

这里会告诉你

整个程序运行需要的时间

还有需要的运行缓冲液的体积

我们点击Start

这里弹出方法是否需要保存

我们可以保存我们的方法

选中你想保存的位置

起名

第二步让你输入的名字

是整个实验结果的名字

保存之后实验即将开始进行

现在

程序已经开始大家可以看到

界面上出现了一条紫色的线

这是我们4通道上的信号线

整个实验的这个坐标

横坐标是时间

纵坐标是反应值

刚开始是基线

基线是由芯片表面

和缓冲液共同组成的

之后仪器将会自动检测我们的进样

发生的信号变化

现在我们的配体

固定的程序已经结束了

我们现在来看一下结果

当固定程序结束的时候

它会弹出一个Results的框

它会告诉你

你的最终结果固定了多少

我们设定的

固定的目标是1200 RU

现在我们固定的是1199 RU

是比较接近的

当乙醇胺封闭以后

我们的固定的值是1365

我们现在把这个窗口叉掉

现在是整个我们固定的Sensorgram

大家可以看到

这个界面横坐标是时间

纵坐标是Response

整个固定的程序分为几个部分

第一个峰显示的是预富集的峰Preconcentration

我们的配体是在10 mM的醋酸钠里面稀释的

这个步骤就是为了估计

我们预富集的情况

随后走的是50 mM的氢氧化钠

它的目的是把残留的配体洗掉

之后就进入正式的固定的步骤

首先是EDC NHS的活化

这个活化时间是七分钟

七分钟之后

系统将自动取样

开始进行加样

直到加样的结合信号

达到了我们预设的1200 RU

随后最后一步是用乙醇胺封闭

乙醇胺封闭的目的

是将活性基团全部封闭掉

防止它们干扰后面的分析物结合的实验

固定好配体后

我们下一步就要检测

分析物和配体之间有无结合

结合实验需要设置对照通道

通过对照通道

来消除容积差等信号干扰

大家可以看到

扣除掉对照通道信号后

才是真正的分析物与配体的结合信号

这是一张分析物结合的传感图

首先在固定好配体的芯片上

用缓冲液建立基线

然后仪器以恒定流速自动注入

合适浓度的分析物

实时跟踪分析物与配体的结合过程

仪器停止进样

并切换到缓冲液

实时跟踪

分析物

配体复合物的解离过程

反应复合物的稳定性

仪器自动读出的报告点反应了结合信号

而结合和解离过程的斜率

反映了互作的动力学

加样的浓度我们可以从有结合信号开始

提高浓度至

结合曲线出现饱和趋势

这和亲和力有关系

现在我们进入实验的第三阶段

再生步骤

如果分析物解离很慢

不能在合适时间完全解离

则会占据配体位置

干扰下一个分析循环的准确性

这时候就需要进行再生

再生是指再生液将和配体结合的分析物分子

从芯片表面上彻底除去

同时保持芯片表面配体活性

再生条件是需要摸索的

如果分析物解离的很快

能够自己回到基线

则不需要再生

这张图反应的就是一种

快结合快解离的互作方式

在做好上述步骤后

我们就可以测定一对生物分子之间

相互作用的动力学和亲和力了

在Biacore实验中

获得亲和力有两种方式

一种是动力学分析 一种是平衡态分析

动力学分析是通过kd/ka得到KD

平衡态分析则适合快结合快解离的方式

因为整个速度太快了

我们无法得到准确的动力学数据

所以它的亲和力要通过平衡态来分析