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大家好

我是来自GE生命科学蛋白纯化

相关产品的产品经理

今天非常高兴

由我来给大家介绍

多模式层析技术这一章节的内容

这一部分内容

我们主要会通过以下几个方面来进行介绍

首先什么是多模式层析技术

其次多模式层析技术

现在有哪些种类

以及各自的原理和相关的应用举例

最后会对多模式层析技术

进行一个总结

在对多模式层析技术进行讲解之前

我们先来看一下

层析填料的发展历程

层析技术的进步

很大一部分体现在填料的更新

填料的更新主要有两个纬度

一个是对基架的更新

以获得更好的刚性

更高的载量

更高的分辨率

GE公司在60年前

上市了Sephadex这一基架

奠定了整个层析填料基架的发展历程

从Sephadex到Sepharose

以及到后面大家常用的Sepharose FF系列

经历了非常长的一个发展历程

我们现在常用的是

Capto系列的基架

Capto基架呢为我们的层析填料

提供了更好的刚性

那么另外一个维度

则是配基种类的更新

大家众所周知

配基的性质决定了填料的选择性

我们熟知的配基有

离子交换

疏水层析和亲和层析

那么多模式的诞生呢

让我们的配基种类

有了更多的选择

那在面对一些复杂蛋白的纯化难题时

单一原理的配基

比如离子交换或者疏水

可能没有办法很好的解决我们的问题

因此呢诞生了多模式

这一种全新的层析技术

多模式层析顾名思义

是指利用一种以上的相互作用模式

彼此单独或者协同发挥作用

的层析技术

在多模式层析技术中

配基和目标分子往往

会通过两种甚至两种以上

模式的相互作用

而这些相互作用的强弱

取决于不同的目标分子

和整体的实验条件

那为解决一些有挑战的

纯化项目

或者提高传统层析工艺的效率

提供了新的思路

目前GE提供的多模式层析填料

分为以下两大类

第一类为离子交换加疏水作用

另外一类是离子交换

疏水加凝胶过滤

三种的层析技术的结合

首先我们来看

离子交换作用加疏水作用

相结合的多模式层析

在这一大类里我们有

复合模式弱阳离子

Capto MMC系列

和复合模式

强阴离子

Capto adhere系列

这两个系列共同特点是

具备了离子相互作用的位点

和疏水相互作用的位点

以及氢键相互作用的位点

那么在这三种相互作用下

到底谁在发挥最主要的作用

我们都知道

在离子交换实验中

结合强度会随着盐浓度的升高而下降

而疏水相互作用则相反

结合强度会随着盐浓度的升高而上升

而Capto MMC

和Capto adhere系列

采用的是离子交换和

疏水相互作用的总和

因此在作用的过程中

是两者相互作用的一个加和

因此

将离子交换和疏水作用相结合的

多模式填料

从原理上是可以看到

我们可以跨越等电点进行结合

相对于传统的离子交换

有着非常大的优势

那么什么情况下

会用到我们的多模式层析技术呢

首先其他单一的技术

无法达到我们想要的选择性

比如离子交换层析里面

无法通过单一的

盐浓度洗脱

来达到我们要的分辨率

第二

填料需要耐受含有一定的盐浓度的样品

比如说我们的样品

无法通过前处理来去除

其中的盐浓度

或者我们的样品

需要在一定的盐浓度情况下

才能够稳定的存在

最后

希望能够精简和优化

现有的层析工艺步骤

因为我们都知道

层析工艺步骤越多

我们的回收率就会有一定的下降

比如说接下来大家看到的Capto MMC系列

它可以在高盐的情况下结合蛋白

相对于常规的离子交换

提供了全新的选择性

从我们举的案例里面

可以看出Capto MMC

在一定的盐浓度里面

也可以跟样品有一个非常好的结合

而传统的离子交换

在盐浓度达到一定的程度后

很快的就将样品流穿出来

没有办法做到结合

而Capto adhere

在抗体精细纯化中

能够一步解决掉我们

相关杂质的去除

在传统的抗体纯化工艺中

在亲和层析步骤后面

通常会加一步阳离子一步阴离子

来去除到我们相关的杂质

而adhere 可以通过一步的层析步骤

将抗体纯化里面的

聚集体 片段

电荷异构体

HCP宿主蛋白

以及DNA以及病毒进行一定的去除

从而大大提高我们的回收率

多模式层析填料在洗脱模式上的选择

也与我们的传统

离子交换和疏水不同

除了常用的盐溶度梯度外

那还可以采用pH梯度

甚至于pH和盐浓度

同时改变的方式

进行洗脱条件的摸索

对于复杂蛋白或者性质非常接近的

蛋白纯化

提供了新的思路

我们再来看一下

离子交换和疏水作用

相结合的多模式填料

有哪些应用

那么Capto MMC的研发

起源于重组白蛋白的纯化工艺中

有一步无法通过传统离子交换

来解决的问题

因为在重组白蛋白的纯化工艺里面

样品需要在一定的盐浓度下面

才能稳定

并且这些盐浓度

不能通过前处理去除

所以我们没有办法选择

离子交换层析

来进行这一步的纯化

因此Capto MMC就是在这种需求下

被研发出来

并且上市的

除了重组白蛋白之外呢

我们在重组胰岛素的纯化中

大家也 可以看到

在精细纯化这一部分呢

可以达到更高的纯度

以及到后面我们把Capto MMC

应用到百日咳三组分的层析纯化工艺中

在这一步的纯化工艺呢

将我们的生产效率得到了一个提升

Capto adhere在前面已经提到了

在抗体纯化工艺中

一步能够解决亲和层析以后

杂质去除的问题

除此抗体工艺的应用之外

我们在流脑多糖疫苗

和肺炎多糖疫苗

的纯化工艺中

也能够解决

单一的离子交换或者疏水相互作用

达不到我们的分辨率的问题

这张图就显示了我们

肺炎多糖疫苗整体的纯化的流程

大家可以看到

Capto adhere在几种组分的纯化过程中

都发挥了很好的作用

那打破了离子交换

和疏水相互作用的壁垒之后

我们在想

可不可以将两种以上的

层析原理相结合

为我们的层析工艺提供更多的选择性

那就是接下来我们要介绍的Capto Core系列

Capto Core系列是由

惰性的凝胶过滤外壳

和带有离子和疏水基团的内核组成

大家可以看到

凝胶过滤外壳的拦截孔径

是700KD或者400KD

大于700KD和

400KD的分子

会直接流穿出来

不进入到内核

而小分子则会进入到内核

通过离子交换或

疏水作用被吸附在填料上

从原理上我们可以看到

Capto Core系列非常适合

大颗粒物质的纯化

比如说病毒疫苗

在病毒疫苗纯化工艺中

传统的工艺流程

采用凝胶过滤的方式

凝胶过滤的方式两大受局限的点是

上样量和流速

但是如果采用Capto Core系列

大颗粒的病毒分子

会直接走流穿

而杂质则会进入到内核被吸附

从而大大提高了纯化的速度

和样品的处理量

那在接下来的我们举的案例里面大家可以看到

在鸡胚流感疫苗的纯化以及狂犬疫苗的纯化中

Capto Core 700相较于

传统的Sepharose 4FF填料

上样量和流速均提高了5倍

那同时呢Capto Core系列对于DNA

宿主蛋白等杂质的去除效果也非常明显

最后我们对多模式层析进行一下总结

多模式层析技术

不同于传统的层析技术

它将多种层析原理相结合

为我们的层析思路

提供了不同的选择性

那么并且有更好的缓冲液兼容

比如说能够耐受我们的高盐溶液

并且能够跨越等电点结合

多模式层析填料能够简化我们的层析工艺

为我们层析效率的提升打下了非常好的基础