当前课程知识点:蛋白质表达纯化与功能研究 > 第四章 蛋白质相互作用 > 4.1蛋白相互作用技术及应用 > 4.1.1
大家好
我是来自上海交通大学医学院的
徐见容
今天给大家介绍的是
蛋白质相互作用的技术及其应用
前面我们很多老师已经
介绍了非常丰富的
蛋白质表达和纯化方法
那么通过上述表达和纯化方法
得到的蛋白质
可以用来做怎样的研究呢
比如说可以得到一些
蛋白的晶体结构
可以通过电镜
直接看到蛋白质的结构
那么此外
我们还需要做很多
其它的功能的表征
首先
我们介绍一下我们今天主要
介绍的蛋白相互作用的检测对象是什么
在生命体中
主要有这么几类物质
蛋白 核酸以及各类小分子
当然
其中就包括糖等其它的物质
所以今天我们主要介绍的相互作用
实际上就是
蛋白与蛋白的相互作用
蛋白与核酸的相互作用
以及蛋白与小分子的相互作用
那么检测上述相互作用
有哪些方法呢
比如说酶联免疫吸附测定法
实际上就是ELISA方法
此外
还有免疫共沉淀
酵母双杂交等其它经典方法
今天我们就介绍几类
标记和非标记的实验方法
首先
我们介绍表面等离子体共振分析
表面等离子共振分析是通过
分子吸附在
重金属膜上引起介电常数
及折射率的变化
来检测分子相互作用
对等温滴定量热法ITC而言
它是通过监测结合过程中
热量的变化信息
从而提供相互作用的热力学信息
对于生物膜干涉而言
它是通过检测蛋白分子
结合传感器之后产生的
生物膜对于光波的干涉变化
对于微量热泳动MST而言
它主要是观测
微观的温度梯度场中分子的移动
进而表征生物分子间的相互作用
但是该方法需要通过荧光的标记
对于NMR核磁共振分析方法而言
它需要同位素的标记
进而产生化学环境的变化
检测分子相互作用过程中的
整个动力学变化信息
不同的方法都有其各自的特点
我们简要了解一下它们的特点
对于SPR方法而言
它可以非常灵敏
准确地测定相互作用中的
动力学参数信息
它可以知道结合和解离的整个过程
但是该方法需要将一个分子
固定在芯片表面
此外
该方法涉及到流路系统
维护成本相对比较高
对于ITC方法而言
该方法可以测定相互作用中
微量的热变化
进而可以直接通过滴定的方法
得到化学计量比信息
是该信息的首选测定方法
但是该方法对蛋白的消耗比较多
很多实验难以达到实验要求
对于BLI方法而言
该方法没有流路系统
所以维护成本相对比较低
而且可以适用于相对复杂的样品体系
但是受限于该方法的原理
其灵敏度以及方法误差
都要较SPR更差
对于MST而言
该方法不需要固定任何一个样品分子
但是它需要对其中的一个样品
进行荧光标记
而且相关的原理
至今还没有特别阐明
今天我们主要介绍一下SPR方法
SPR是表面等离子体共振的简称
该方法的基本原理是
当光线由光密物质入射
进入光疏物质的时候
将在界面表面产生消逝波
而对于重金属而言
它的表面存在等离子层
该等离子层存在一个等离子波
当入射光线的消逝波
与等离子波产生共振的时候
该信号可以被表征
可以被检测
测定的结果
我们称之为SPR角
该方法的特点是
它的响应不依赖于具体的样品种类
只依赖于与金属膜结合的分子质量
所以本质上它是一台
质量超级敏感的光学检测器
而且它的响应信号是
可以准确定量的
一般来讲
每平方毫米一个皮克的质量
会被定义为一个单位
实现SPR方法的仪器有很多
其中BIAcore是最经典的
SPR仪器
该仪器主要由三个重要部件组成
第一是光学检测器
第二是它的传感芯片
第三是它的微流控系统
下面我们依次做个介绍
对BIAcore芯片而讲
在玻璃基质表面有金涂层
该涂层为50纳米厚的金膜
它可以提供表面等离子体
为了适应不同的应用体系
和应用对象
BIAcore提供了非常多的芯片种类
供大家选择
此外
还提供了非常多的各种
试剂盒供大家选择
对于微流控系统而言
它的核心部件是流通池
该流通池可以实现
不同通道流通方式的控制
可以实现单通道
双通道以及四个通道
同时控制
对于右边经典的
BIAcore图谱而言
我们可以看到
首先我们需要将其中的一个分子
固定在芯片的表面
然后我们进样分析物对它进行分析
分析物与固定在芯片表面的
分子可以产生结合
该结合将影响表面等离子体特性
从而被检测到 产生响应信号
这就是我们看到的结合过程
在结合完成之后
它可以达到平衡状态
此后
通过buffer的冲洗
结合在芯片表面的分子
将逐渐地解离下来
产生一个解离的信号
解离完成之后
我们可以通过再生的方式
将芯片表面没有解离的
分析物分子全部再生掉
从而获得一个新的表面
以供后续分析
前面已经给大家介绍了
SPR方法的基本原理
仪器组成以及它的芯片类型
那么SPR到底可以用来
做怎么样的研究呢
现在给大家介绍几个
不同的应用实例
首先
我们看一下
SPR有怎样的应用场景
第一个 我们需要检测
两个分子之间到底是有
还是无相互作用
这个时候我们往往会考虑
这种结合是特异性的结合
还是非特异性的结合
它是否具有比较好的选择性
在此基础上
我们往往还会测定两个分子
结合的亲和力
以及它结合速率的动力学如何
这种方法往往会应用到功能复合体
以及各种相互作用的研究中去
此外
BIAcore方法还可以用来测定
分子相互作用中的热力学信息
以及对目标分子的含量
或者说活性进行测定
下面我们先介绍第一个实例
第一个实例是一个通用分析
主要是蛋白与蛋白的相互作用
首先
我们需要将其中一个分子
固定在芯片的表面
然后我们将分析物
由芯片的表面流过
让分析物与芯片表面结合的
配体进行结合
在分析完成之后
我们将芯片表面进行再生
再生之后
我们将分析不同浓度梯度的样品
然后获得梯度的数据
并对上述数据进行拟合分析
那么
当我们实际上需要分析
一对蛋白-蛋白相互作用的时候
我们将如何着手呢
以抗原-抗体相互作用为例
当我们希望检测抗原-抗体
亲和力的时候
我们将如何去做呢
我们检测到的结果又是如何
获得亲和力常数信息的呢
因为BIAcore方法需要
固定其中一个蛋白
那么我们首先遇到的问题就是
对于抗原和抗体
我们应该固定哪个蛋白呢
这种固定对结果有没有影响呢
从数据分析的角度而言
我们通过系列浓度的分析
我们可以得到梯度的数据
通过对上述数据的动力学拟合模型
我们可以得到结合的速率常数
以及解离的速率常数
通过解离的速率常数
比上结合的速率常数
我们可以得到上述两个蛋白相互作用的
亲和力结果
那么对于固定抗原还是抗体
哪一种方式才能得到更好的结果呢
我们做过实例
我们不仅将抗体固定下来
检测抗原
我们还固定了抗原
检测对应的抗体
发现两者得到的结果是高度一致的
也就是说
只要方法开发得当
无论固定其中哪一个蛋白
我们得到的亲和的信息都是准确可靠的
-总论
-总论
-第一章
-第一章
-2.1 蛋白质表达策略
-2.2 蛋白质电泳与免疫印迹
-第二章测试
-3.1 凝胶过滤层析
-3.2 亲和层析
--3.2 亲和层析
-3.3 离子交换层析
-3.4 ÄKTA实验操作
--3.4
-3.5 疏水层析
--3.5
-3.6 多模式层析技术
--3.6
-3.7 膜蛋白
--3.7.1
--3.7.2
-3.8 病毒
--3.8 病毒
-3.9 水溶性蛋白
-第三章测试
-4.1蛋白相互作用技术及应用
--4.1.1
--4.1.2
-4.2 Biacore实验设计和操作
--4.2.1
--4.2.2
--第四章测试
-结束
-结束