4.1.2在线视频

上面的实例是通用的蛋白-蛋白分析

那么第二个实例呢

给大家介绍蛋白与核酸的分析

这也是一类非常重要的分析类型

因为我们很多的蛋白实际上是

通过调控与核酸的相互作用

实现它的功能的

比如说

对于核仁氧化应激反应而言

NPM1蛋白

它就是通过与核酸的相互作用

产生细胞功能调控的

对蛋白与核酸相互作用而言

我们既可以将蛋白固定下来

也可以将核酸固定下来

但是在实际应用中

我们往往优先考虑将核酸固定下来

毕竟通过生物素标记核酸

是最通用的处理方式

因为我们知道生物素可以跟

链霉亲和素蛋白产生特异性的

几乎约等于共价的结合

因此

我们可以采用SA芯片

该芯片

它在葡聚糖基质的表面

偶联了一层链霉亲和素蛋白

因此我们只需要将

该芯片的表面进行活化

就可以直接捕获

生物素标记的核酸分子

但是该方法也有它的局限性

因为

生物素跟链霉亲和素的结合非常强

难以被再生下来

因此该芯片就难以被重复使用

根据这个情况

BIAcore开发了

Biotin CAPture Kit

该kit与SA芯片不同之处在于

Biotin CAPture Kit通过

核酸-核酸之间 链的互补作用

捕获链霉亲和素蛋白

而不是直接共价的

固定链霉亲和素蛋白

对于NPM1蛋白而言

我们发现

该蛋白在关键位点突变前后

它与GSSG的（结合）响应产生变化

在突变之前

GSSG可以通过氧化该位点

使得NPM1蛋白

与核酸的结合增强

但是该位点突变之后

GSSG对蛋白与核酸相互作用

增强的作用消失

在实例3

我们主要介绍一下

化合物活性的通用分析方法

磷酸甘油酸脱氢酶

PHGDH

这是一个有533个氨基酸的蛋白

该蛋白分子量为56.6KDa

它的等电点为6.72

因此我们判断

可以通过氨基偶联的方式将

该蛋白固定在芯片表面

我们对一系列的小分子

进行筛选和分析

它们获得了

浓度依赖性的结合响应曲线

通过对它们的响应曲线进行拟合

我们可以得到一系列的

亲和力结果

但是对于小分子而言

它往往出现结合快

解离快的情形

因此

用前面提到的动力学模型

就很难对其亲和力进行拟合

这种情况下

我们往往采用另外一种模型

这种模型就是稳态拟合模型

因为小分子与蛋白的结合

可以迅速的达到平衡状态

因此我们可以取

每个浓度下

小分子与蛋白结合后

达到平衡时的响应值

作为该浓度的响应值

并对它进行

浓度依赖性曲线作图和拟合分析

通过这样的分析

我们可以直接得到它的KD值

通过上述分析

我们对一系列小分子的

亲和力值进行了比较

我们发现

对于该蛋白的内源性配体

3-磷酸羟基丙酮酸而言

我们测得的亲和力为17.12μM

与文献报道的20μM左右非常一致

此外

我们还测定了NADH的响应值

根据我们测定的结果

NADH的响应值为0.4μM

也与文献报道值高度一致

事实上

很多时候我们需要研究

三者之间的相互作用

比如说影响蛋白与蛋白

相互作用的药物筛选

我们以RAGE蛋白

与Abeta蛋白为例

RAGE蛋白可以

介导Abeta转运入脑

产生相关神经毒性

因此寻找能够抑制

RAGE蛋白与

Abeta结合的小分子

就可能找到减缓阿尔兹海默病

病理进程的方式

我们获得了RAGE蛋白

是一个商品化的蛋白

但是该蛋白的缓冲液中含有Tris盐

但是（同时）该蛋白是带有

FLAG-tag标签的

因此面对这些信息

我们首要考虑的是

如何固定RAGE蛋白

以及如何筛选和验证

影响RAGE蛋白与

Abeta结合的小分子抑制剂

我们选择了先固定Flag抗体

再捕获该蛋白的方式

通过将Flag抗体固定在芯片的表面

我们可以通过

亲和的方式将RAGE蛋白

捕获在芯片表面

但是我们在实际操作过程中发现

偶联的Flag抗体

并不能够非常非常有效的

捕获RAGE蛋白

其捕获量只有不到一千个单位

而我们需要测定的实际上是小分子

事实上低于一千的捕获量

是非常难以测定小分子的

首先

我们就使用直接结合的方法

将100μM的小分子

与芯片表面捕获的RAGE蛋白进行结合

实验结果发现

小分子与RAGE蛋白均无结合

事实上

这极有可能是假阴性的结果

毕竟如此低的捕获量

很可能是检测不到小分子信号的

那在这种情况下

我们该如何解决呢

考虑到我们实际的筛选目的

是为了获得抑制

RAGE蛋白与Abeta蛋白

相互作用的小分子

因此我们尝试采用了竞争结合法

我们将固定浓度的Abeta

与RAGE蛋白结合作为一个对照

然后将含有100μM小分子的

相同浓度的Abeta蛋白

与RAGE蛋白结合

如果说小分子能够抑制上述

Abeta与RAGE蛋白的相互作用

那么我们可以发现

Abeta与RAGE蛋白的结合

是下降的

通过对两百个化合物进行筛选

我们得到右图的结果

该结果中我们可以发现

绿圈标记代表

没有添加小分子的

Abeta蛋白

它们的响应值虽然持续下降

但是它们是保持相对稳定的

而黄色圈所圈起来以及

红色圈所圈起来的化合物

则表现出显著的抑制作用

特别是化合物A

我们发现化合物A显著的抑制

Abeta多肽与

RAGE蛋白的结合

它的IC50值

为7.316μM

而对于化合物D而言

它则能够浓度依赖性地促进

Abeta与RAGE蛋白结合

它的EC50值为1.17μM

下面我们介绍第五个实例

BIAcore在抗原-抗体

相互作用特性表征方面的应用

双特异性抗体是现在非常热门的

一类抗体

往往需要通过双特异实验来验证

它可以同时与两个抗原结合

我们先将一个抗原固定在芯片表面

然后我们进样

双特异性抗体进行分析

我们发现双特异抗体

可以跟抗原A非常好的结合

而且迅速达到饱和

在此基础上

我们进样的抗原B

我们发现抗原B可以在

双特异抗体的基础上

进一步与双特异抗体结合

作为比较 前面的普通IgG抗体

就没有表现出这种特性

因此通过上述方式

我们就鉴定该双特异抗体确实

可以与抗原A抗原B同时结合

此外

我们还经常利用BIAcore

对抗体的结合表位进行鉴定

比如说对于两个不同的抗体

我们往往会固定一个抗原

然后将抗体A进行进样分析

抗体A

可以很好的与抗原结合产生信号

在此基础上

我们会进一步地结合抗体B

如果抗体B与抗体A

在抗原上结合位点是一样的

那么两者将会产生竞争

使得抗体B的结合信号无法被检测

对于抗原而讲

如果抗体B与抗体A

作用的位点是一致的

那么第二次进样抗体B的时候

往往不能产生

结合信号

但是如果抗体A与抗体B

分别结合在抗原的

不同抗原决定簇上

那么此时就可以同时产生

抗体A的结合信号以及抗体B的

二级结合信号

这样我们就可以比较好的鉴定

抗体的结合表位到底是一致的

还是不一致的

最后

我们再把今天的学习内容进行

一个小结

首先我们介绍了

蛋白相互作用的对象

以及经典的检测方法

与最新的生物物理学的检测方法

特别是我们介绍了

不同的生物物理学方法

它们各自的优点以及局限性

在此基础上

我们侧重介绍了SPR方法

SPR方法的原理

以及它的仪器组成

我们列举了五个实例

分别从蛋白-蛋白相互作用

蛋白-核酸相互作用

蛋白-小分子相互作用

以及三者相互作用

还有BIAcore在抗原-抗体

相互作用表位鉴定中的应用

谢谢大家