3.3.1 离子交换层析（上）在线视频

大家好 我是聂焱

来自上海科技大学

在这节课上

我会为大家介绍离子交换和疏水层析

这两种蛋白纯化方法

同学们在前面两节课中

学习了凝胶过滤层析和亲和层析

这两项蛋白纯化技术

凝胶过滤层析

主要是根据蛋白质分子的大小和形状的不同

来进行分离纯化

而亲和层析

主要是利用目标蛋白质分子

能够与亲和层析填料

进行专一性和可逆性结合的特性

来进行分离纯化

而我们这节课上

将要介绍的离子交换层析和疏水层析

顾名思义

则是分别根据蛋白质分子表面的电性

和疏水性的差异来进行分离纯化

所利用的

主要是蛋白质分子本身的理化性质

同学们在学习了这堂课的内容之后

相信也能够更好地理解

和掌握下一节课上要讲到的

多模式层析技术的内容

我们先来大致的了解一下

离子交换层析和疏水层析

这两种蛋白纯化方法的特点

我们先说离子交换层析

顾名思义

这是指生物分子由于某些基团的电离

从而在表面带有正电荷或者负电荷

这些带有电荷的生物分子

会被吸引到

带有相反电荷的层析填料上

从而实现样品的捕获 分离和纯化

例如在左边蓝色方框里

示意图所显示的

红色的带负电的目的蛋白

被层析填料表面带正电的蓝色基团所捕获

因为许多生物大分子

都含有可以电离的基团

在一定的环境条件下

可以带有表面电荷

所以离子交换层析

在生物大分子的分离 中等纯化及精制等步骤

具有非常广泛的应用

现在我们再来看一下疏水层析

从名字上可以看出

这是利用表面疏水性的差异

来分离和纯化生物大分子的一种方法

对可溶蛋白

溶剂是水

所以疏水的氨基酸侧链

多数会被包埋在蛋白质内部

但因为蛋白质最终的三维结构

是最适合周围溶液的热动力学的折衷结果

所以部分疏水氨基酸侧链也会暴露在外

从而在蛋白质表面形成疏水区域

这些疏水区域在特定条件下

便可以与层析填料上的疏水功能基团相互作用

以实现样品的捕获和后续的分离纯化

要理解蛋白质为什么会带有表面电荷

首先要理解组成蛋白质的氨基酸的理化性质

大家在中间的这张图上

可以看到21种氨基酸

根据它们的理化性质而被分为四大类

根据它们理化性质而被分为四大类
离子交换层析的原理和疏水层析的原理其实是相通的

是否可被电离？

极性还是非极性

我们先重点看一下上面的蓝色方框里面的

五种可电离的氨基酸

精氨酸 组氨酸 赖氨酸

在生理pH值下带正电

而右边的天冬氨酸和谷氨酸

在生理pH值下则带负电

这些可电离氨基酸侧链基团的数量和类型

决定了蛋白质分子表面的电荷情况

由于不同蛋白质分子表面的

电荷情况通常是不同的

这一差异

便可用来分离和纯化我们感兴趣的目的蛋白了

氨基酸的数量和种类

是否就是决定蛋白质表面电荷的唯一因素呢

其实并非如此

因为可电离的氨基酸侧链

属于弱酸或弱碱

所以

蛋白质分子

所处的环境

一般是指溶液的pH值

也会对蛋白质所带的电荷产生影响

请同学们看一下屏幕中间的这张

蛋白质的滴定曲线图

图中绿色的曲线代表的是

某一个特定的蛋白分子

在不同pH条件下的总体净电荷

我们先看一下绿色曲线

和横坐标轴相交的位置

这个位置对应的就是

这个蛋白的等电点

isoelectric point

简称pI

当pH等于pI的时候

这个蛋白的总体净电荷为零

也就是指带正电和带负电的侧链数量相同

我们再来看左侧

当环境pH小于pI时

一些原本不带电的侧链

容易获得带正电的质子

所以蛋白的净电荷为正

我们再看看右边

正好是相反的情况

溶液的pH大于pI的时候

因为侧链容易失去带正电的质子

所以蛋白的净电荷为负

因此

在设计离子交换层析实验时

缓冲液的pH值

是一个非常重要的参数

有意思的是

有蛋白组学的研究结果表明

大多数物种的蛋白质在生理环境下

也就是pH为7.4的时候

通常都是带电荷的

同学们可以看一下这两个直方图

左边的是大肠杆菌蛋白质的pI的直方图

右边是人类的

图的纵坐标轴

是指pI在某一个范围内的蛋白质的数量

占该物种所有蛋白质的比例

横坐标则是指pI值

我们可以很明显地看到两个峰

峰的中点大约是5.8和9

说明绝大部分蛋白质的pI离这两个值不远

由于这两个值和生理pH7.4差得较远

所以可以推导出

蛋白质在生理环境中通常是带电荷的

这一结论

另外

如果同学们仔细观察峰的分布

可以看到

pI在5.8附近的蛋白

多于pI在9附近的蛋白

这说明大多数蛋白在生理pH值下带负电荷

能够结合带正电荷的层析介质

也就是阴离子交换填料

在这里也要请同学们注意

阴离子交换填料

指的是一类能够结合阴离子的层析填料

而不是指这类填料本身含有阴离子

我们来看一段GE公司

制作的介绍离子交换层析原理的视频

离子交换层析的分离纯化

依赖于带有电荷的分子

与带有相反电荷的功能基团相互之间的可逆作用

大多数离子交换层析实验

由四个实验步骤组成

平衡

上样和清洗

洗脱和再生

第一步是将固定相平衡至理想的状态

当该步骤完成时

固定相表面的功能基团

都和带有相反电荷的抗衡离子

可逆地相互结合

例如钠离子和氯离子

第二步是上样和清洗

这一步的目的是捕获目的分子

并去除无法紧密和填料结合的杂质分子

样品所在的缓冲液

应该具有与起始缓冲液相同的pH和离子强度

从而使得功能基团

能够和带有相反电荷的蛋白质分子相结合

在第三步的洗脱流程中

生物大分子

通过和洗脱缓冲液中的离子

进行交换而得以被洗脱下来

通常的洗脱方式

是通过添加氯化钠

或其它盐来增加溶液的离子强度

从而将结合在填料上的蛋白洗脱下来

蛋白质被洗脱下来的顺序

和其表面电荷基团的数量有关

最后一步是再生

目的是把所有结合在填料表面的剩余分子洗脱下来

这一步骤保证了填料在进行下一轮实验时

仍然具有相同的结合能力

好

我们现在来看一下

用来进行离子交换层析实验所需的设备

装置的作用是把结合缓冲液

洗脱缓冲液

以及样品通过系统泵 进样泵 进样阀等元件

加载到层析柱上

大体积的样品

可以通过进样泵直接加载到系统中

而小体积的样品

则可以通过注射器来加载

随后

样品被缓冲液推过柱阀

经过红白相间的层析柱

完成后续的清洗

洗脱等纯化流程

这些样品在被收集之前

还会经过一系列的检测器

例如紫外检测器 电导检测器等

这些检测得到的参数

会用于绘制色谱图

那么红色色谱的数据来自电导检测器

对应盐浓度的变化

蓝色色谱的数据则来自紫外检测器

对应蛋白数量的变化

这些数据可以帮助我们来判断

这个实验的效果

和定位我们感兴趣的目标样品的洗脱位置

从而进一步对洗脱得到的样品进行表征和分析

好了

相信同学们现在应该已经对

离子交换层析基本原理有了一定认识

下一部分

我将为同学们讲解

设计和开展离子交换层析实验的主要步骤

和注意事项