3.5在线视频

下面我们简要地介绍一下疏水层析

包括原理 实验步骤

在纯化工艺中的位置

以及小结

我们再回头看一下

这张标明了不同氨基酸理化性质的图

下方红框里框出的是疏水氨基酸

例如丙氨酸 亮氨酸 异亮氨酸等等

这些氨基酸残基

使得一些蛋白质分子的部分区域

具有了疏水性

填料上的疏水基团

与蛋白表面疏水区域结合的原理

是熵增驱动

在左图中可以看到

由于水分子无法和填料上的疏水基团

和蛋白表面疏水区域相互作用

于是便在这些疏水表面 周围

形成了一个高度有序的水分子壳层

在右图中可以看到

增加溶液的盐浓度时

疏水作用也得到了增强

这是因为疏水区域的相互结合

将导致疏水区的整体表面积减少

从而使得处于有序状态的水分子数量减少

在热力学上更加有利

反之

降低溶液盐浓度

将减弱疏水作用

我们来看一段GE公司制作的

介绍疏水层析原理的视频

疏水层析的分离

纯化依赖于生物分子的

疏水性以及可逆的吸附作用

大多数疏水层析实验

由四个实验步骤组成

平衡

上样和清洗

洗脱和再生

第一步是将固定相（填料）

平衡至所需要的状态

这是通过在流动相（缓冲液）

中加入盐来实现的

常用的平衡

缓冲液含有50 mM磷酸钠

1-1.5 M硫酸铵

第二步是上样和清洗

这一步的目的是捕获目的分子

并去除无法紧密和

填料结合的杂质分子

分子与填料之间的结合

依赖于适量的盐浓度

盐浓度的选择

以能获得最佳的实验结果为准

在第三步的洗脱流程中

生物分子由于溶液组分的改变

而从疏水的填料表面被洗脱下来

通常的方法是降低溶液的盐浓度

可以用梯度洗脱的方式

来将目的分子

与其它粘附在填料上的分子分离开来

一般有10-15个柱体积的梯度就足够了

最后一步是再生

目的是把

所有结合在填料表面的剩余分子洗脱下来

这一步骤保证了填料

在进行下一轮实验时

仍然具有相同的结合能力

我们下面举例说明一下

蛋白质表面疏水性差异

对于洗脱顺序的影响

同学们看一下这张色谱图

左边的纵坐标轴对应的是UV吸收值

右边的纵坐标轴对应的是

缓冲溶液中盐浓度的变化

下面的横坐标轴

代表蛋白质表面的疏水性

从左往右逐渐增强

每个蛋白的名字下面是它们的结构

结构表面的黄色部分

是疏水性的氨基酸残基

可以看出黄色部分的比例

的确是从左往右逐渐增多的

这也对应了蛋白质的疏水性

从左往右逐渐增强

那它们会被盐浓度不断降低的溶液所洗脱出来

疏水层析的实验步骤

和离子交换层析的步骤是一样的

但疏水层析的样品

吸附需要高盐浓度的环境

样品洗脱需要低盐浓度的环境

这和离子交换层析的情况

正好是相反的

我们再来看一下

疏水层析在纯化工艺流程中的位置

疏水层析可以与离子交换层析

交换和交替使用

同时

也可以作为亲和层析 盐析等

纯化方法的下游纯化步骤

一个应用实例

是从毕赤酵母中

纯化重组表达的α-甘露糖苷酶

其中

疏水层析的纯化步骤

获得了10倍的纯化倍数和82%的收率

我们小结一下疏水层析这部分内容

疏水层析的原理是熵增驱动

实验步骤与离子交换层析基本一样

最关键的区别是高盐上样 低盐洗脱

正好与离子交换层析相反

疏水层析的影响因素这部分内容

由于时间关系

在这节课上就不展开讲述了

同学们如果有兴趣的话

可以看一下这节课的扩展阅读材料

最后

疏水层析工艺

在纯化工艺中的位置比较灵活

既可以用于盐析 变复性

高盐除核酸等步骤之后

也可以与离子层析交换和交替应用

最后

推荐大家在课后继续阅读

GE Healthcare

生命科学产品使用手册中的相关内容

这套手册有中文和英文两个版本

英文版本可以很方便地在GE公司的网站上

下载到

除了各类层析方法之外

还有不少与蛋白分析相关的内容

好了

这节课的内容就到这里

希望同学们通过这堂课

对于离子交换层析

和疏水层析这两种纯化方法

能有一个比较全面的认识

为今后的深入学习和实践

打下一个好的基础

最关键的区别是“高盐上样

低盐洗脱”

正好与离子交换层析相反

“疏水层析的影响因素这部分内容

由于时间关系

在这节课上就不展开讲述了

同学们如果有兴趣的话

可以看一下这节课的扩展阅读材料

最后

疏水层析工艺

在纯化工艺中的位置比较灵活

既可以用于盐析

变复性

高盐除核酸等步骤之后

也可以与离子层析交换

和交替使用

最后

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可以很方便地在GE公司的网站上

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除了各类层析方法之外

还有不少与蛋白分析相关的内容

好了

这节课的内容就到这里

希望同学们通过这堂课

对于离子交换层析

和疏水层析这两种纯化方法

能有一个比较全面的认识

为今后的深入学习和实践

打下一个好的基础

Happy Purification

（祝大家纯化愉快）！（结束）