2.1.2蛋白质表达策略（下）在线视频

下面我介绍一下

昆虫细胞表达系统

昆虫细胞

带有近似于哺乳动物细胞的

翻译后修饰

而且细胞生长条件简单

可提供高蛋白表达水平

那么问题是

如何将表达载体转到

昆虫细胞里呢

这里

我们要利用到杆状病毒

杆状病毒是一类

超大双链环状DNA病毒

因其成员的病毒体

呈杆状而得名

这类病毒能感染昆虫

以杆状病毒作为载体

在昆虫细胞表达外源基因

就形成了

昆虫杆状病毒表达载体系统

因病毒基因组较大

传统的酶切连接方法较为困难

一般

可通过两种方法

产生重组病毒

同源重组和位点特异性重组

其中

利用

细菌转座子原理

在大肠杆菌中

就能完成重组病毒构建的系统

取名为Bac-to-Bac

表达系统

意即从细菌

bacterium

到杆状病毒

baculovirus

革命性地改变了

重组昆虫杆状病毒的构建方法

杆状病毒表达系统

具有安全性高

对外源基因克隆容量大

重组病毒易于筛选等特点

Bac-to-Bac系统

利用了位点特异的Tn7转座子

将构建到

pFastBac质粒上的外源基因

转座到大肠杆菌DH10Bac菌株中的

bacmid病毒质粒中

产生重组bacmid

随后

将Bacmid转染到

昆虫细胞中

生成重组杆状病毒

新生病毒会出芽到培养上清中

被感染细胞会死亡裂解

将病毒液收集

进一步传代繁殖后

即可感染新的昆虫细胞进行表达

值得一提的是

杆状病毒使用PH

P10启动子

等表达目的蛋白

可获得高产量

而且

对于有毒性蛋白

和需要分泌信号来引发糖基化的糖蛋白

可在目的蛋白N端添加

GP67

或蜂毒素及HBM信号肽

来表达分泌型蛋白质

此外

通过MultiBac系统

或不同杆状病毒共感染的方法

可实现多个外源蛋白一起

形成大复合物的表达

哺乳动物细胞表达系统

是适用于生成

具有最天然结构和活性的

哺乳动物蛋白的首选表达平台

可以使用化学试剂

转染质粒DNA

或通过电穿孔

或使用重组病毒进行病毒感染

将目的基因导入哺乳动物细胞中

转染广泛适用于

多种细胞类型

可采用

瞬时表达或

稳定细胞系来表达目的蛋白

瞬时转染

一般可维持几天的高表达

适用于蛋白快速生产

和数据的快速获得

稳定表达需要将

表达载体整合至宿主基因组中

形成稳定的细胞系

由于表达载体包含选择性标记

如抗生素抗性基因

因此可以通过在培养基中

加入筛选试剂

如抗生素

筛选出整合有重组体的细胞

目前

生物医药领域已有

很多种细胞系广泛应用

如HEK293

CHO

Vero等细胞系

那么

是所有的蛋白

都只是把蛋白全长表达出来吗

在载体构建上有什么策略呢

首先

为了便于纯化

我们经常在目的蛋白

N端或C端添加标签蛋白

如His-tag

strep-tag等

此外

标签蛋白

还有帮助蛋白折叠

增加蛋白稳定性

和可溶性

以及方便检测等作用

其中

常见的助溶标签

如谷胱甘肽巯基转移酶GST

麦芽糖结合蛋白MBP

小泛素相关修饰蛋白SUMO等

在原核表达系统中广泛应用

第2点

为了排除助溶标签或

纯化标签对目的蛋白的影响

一般在标签

和目的蛋白之间

引入蛋白酶酶切位点

方便在纯化过程中

通过酶切步骤

去除融合标签

常用的蛋白酶有凝血酶

Thrombin

TEV蛋白酶

以及鼻病毒3C蛋白酶等

第3点

对于难表达的蛋白

要更关注其发挥功能的结构域

做适当截短

比如有些膜蛋白

如果其发挥功能主要是胞外段的话

可以将跨膜区及胞内段去掉

此外

去掉一些柔性区域

有时可能对蛋白结晶有帮助

第4点

N端的信号肽序列

对于真核细胞正确表达分泌蛋白

膜蛋白等非常关键

在设计时要重点关注

第5点

密码子优化

不同物种对密码子的偏好性不同

比如

直接

把人的血红蛋白序列克隆到载体上

在大肠杆菌中表达

会遇到表达量很低的问题

这就是因为序列中

存在大肠杆菌的稀有密码子

影响了核糖体的运动

抑制了蛋白翻译

因此针对目标表达系统

进行密码子优化

重新合成基因

可以清除稀有密码子

利用最佳密码子

去除mRNA去稳定序列

有利于增加蛋白产量

最后

让我们来看两个实例

第一个例子是PD-1的表达

PD-1分子

是目前肿瘤免疫治疗的

关键靶点

通过

抗体阻断

其与配体PD-L1的作用

可以

重新激活

机体免疫系统对肿瘤的杀伤

此项研究获得了

2018年诺贝尔奖

让我们看看

PD-1分子有什么特点

我们可以看到

PD-1全长二百八十八个氨基酸

属于I型跨膜蛋白

N端为信号肽

胞外段含有1个IgV 结构域

含有4个N糖基化位点

随后是跨膜区和胞内段

由于其胞外段

参与与配体PD-L1的结合

所以开发的阻断性抗体

就是是靶向胞外段部分

因此

研究PD-1与配体

及抗体的相互作用

只需要表达纯化其胞外段部分

用三种表达系统

都能成功表达PD-1蛋白

分别是大肠杆菌 体外复性

昆虫细胞表达

哺乳动物细胞表达

通过SDS-PAGE

我们可以看到

三个表达系统表达的蛋白

翻译后修饰差别很大

体现到胶图上就是分子量的差异

复性的蛋白只有十几KDa

昆虫细胞表达的蛋白有二十五KDa

而哺乳细胞表达的分子量

接近四十KDa

这主要是由于糖基化等修饰差异所导致

当对四个N糖基化位点

突变后都会看到蛋白分子量

不同程度的降低

此外

此项研究

通过解析复合物结构

发现百时美施贵宝

开发的Nivolumab识别的是

PD1 IgV

结构域最N端的N-loop

而这段loop

在以往的原核构建中都被截掉了

因此以往一度推测

Nivolumab不结合复性PD1的原因

可能是跟结合PD-1的糖链有关

第二个例子

是流感病毒囊膜表面

血凝素HA的表达

HA蛋白也是I型跨膜蛋白

形成同源三聚体

在流感病毒粒子表面

形成刺突状结构

是帮助病毒侵入细胞的关键蛋白

也是人体免疫系统

抗体靶向的关键抗原

对其表达

我们采用

昆虫杆状病毒表达系统

将其胞外段构建到

pFastBac1载体上

N端添加上GP67信号肽

帮助蛋白分泌

对其表达我们采用

昆虫杆状病毒表达系统

将其胞外段构建到

pFastBac1载体上

N端添加上GP67信号肽

帮助蛋白分泌

C端依次加上Thrombin酶切位点

三聚体标签

和His tag

三聚体标签辅助HA

形成稳定三聚体

His tag用于纯化

因此

纯化该蛋白

需要先进行一步

镍柱亲和层析

然后

通过

阴离子交换柱

进一步纯化

随后加入Thrombin

将标签切掉

最后

通过分子筛层析

获得不带标签的HA蛋白

通过本节内容的学习

相信大家

对蛋白表达策略已经有了基本的认识

也已经开始跃跃欲试

研究自己感兴趣的蛋白

我要告诉大家的是

对于蛋白表达纯化

没有放之四海而皆准的策略

每个蛋白都有自己的特性

只有不断摸索尝试

才能找到最优的策略

另外

该领域一直推陈出新

不断有新的理念创新

和技术创新

需要大家不断学习