3.1 凝胶过滤层析在线视频

同学们好

欢迎回到慕课课程

我叫欧阳波

来自中国科学院上海生化细胞所

从这节课起

我们将开始学习

蛋白质的纯化方法

今天我要跟大家介绍的是

层析方法中的凝胶过滤层析

首先我们了解一下什么是层析

在上两讲中

同学们已经学习了如何通过

大肠杆菌 酵母 昆虫 哺乳细胞等

对目的蛋白进行大量的表达

也学习了如何通过电泳等方法

对目的蛋白进行鉴定

那么在蛋白成功表达以后

我们怎么样才能把这些蛋白从细胞中

分离出来呢

首先我们要通过离心等方式

把细胞收集起来

然后再采用超声

高压均质等方法

将细胞破碎

再采用适当的缓冲液

把蛋白质抽提出来

在抽提过程中

我们所用的这个缓冲液的pH值

离子强度

以及是否要用到这些条件

都要根据蛋白质的性质来决定

最后

我们把抽提取出来的蛋白混合物要去进行

下一步的分离和纯化

拿到我们想要的目的蛋白

蛋白的分离纯化

大致可以分为

粗分离和精细分离两个阶段

在粗分离阶段

主要是把目的蛋白和其他细胞成分

比如说DNA

RNA等分开

那么在精细纯化的阶段

是把目的蛋白

与其它大小以及理化性质接近的杂蛋白

分离开来

目前我们常用的

蛋白质的分离实验手段主要包括

层析法

沉淀法

离心法

透析法

盐析法

和萃取法等等

其中层析法是

多组分混合物最有效的

分离分析方法

也是我们本章节课程中

重点要给大家介绍的方法

层析法的发展

已经有一百多年的历史了

第一个使用层析法的人

是俄国的植物学家茨維特

他在1906年

首次发表论文

采用了碳酸钙作为填料

分离了植物色素

当他把混合的植物色素

在柱子上分开后

那么柱子上出现了各种颜色的条带

所以他把这种方法

起名叫作Chromatography

色谱层析法

Chroma代表的是颜色

graphy代表分离

之后科学家们又不断地发展

新的层析方法

在1942年

英国的Martin和Synge

发展了分配层析法

并在1952年

获得了诺贝尔化学奖

而在1968年

美国和以色列的两位科学家

发展了亲和层析法

层析法发展到今天

已经有了非常多的形式和类型

来满足各个领域的需求

但不管哪一类层析法

都有着共同的基本特点

都是利用混合物中各个组分

理化性质的差异来进行分离的

它们都具备两个相

固定相和流动相

不动的一相

为固定相

携带样品流过固定相的流动体

为流动相

当流动相中的样品混合物

经过固定相时

就会与固定相发生相互作用

由于各个组分在性质结构上的差异

与固定相相互作用的类型

强弱也有差异

因此在同一个推动力的作用下

各个组分

在固定相上滞留的时间不一样

那么而按它们先后不同的次序

会从固定相中流出

目前实验室的蛋白质纯化

一般是由液相色谱仪来完成的

通过配有输液泵

预装柱 检测器 收集器等

液相色谱系统

可以优化分离分析的流程

从而达到自动 快速的分离

其分离的效率 灵敏度 选择性都比较高

可以适合非常复杂的生物样品的分离

被广泛应用于各个领域

在各个学科中都有着非常重要作用

液相色谱仪它的分离核心是层析柱

层析柱里面的填料

决定了分离的选择性和分离度好坏

根据填料的不同性质

目前我们主要使用的几种层析技术包括

凝胶过滤层析

离子交换层析

疏水层析和亲和层析等等

这节课我们先来了解一下

层析技术中

最简单的凝胶过滤层析

那么任何一个技术

我们要想用好它

就需要先掌握它的原理

凝胶过滤层析的原理是什么呢

它是怎么把蛋白质分离开来的呢

凝胶过滤层析中的固定相是

凝胶颗粒

这些颗粒都具有多孔的网状结构

像筛子一样

所以凝胶过滤层析

也被称为分子筛

当样品从色谱柱的顶端向下运动时

流经柱子时

大的蛋白质分子它不能进入网孔

会直接从颗粒的间隙

先洗脱出来

而较小的蛋白质分子

能够进入凝胶颗粒中的网孔

在网孔中穿来穿去

历时会比较长

而后洗脱出来

分子量越小的蛋白质分子

它可以进入的网孔越多

在凝胶中保留时间越长

流出时间就越晚

这样不同大小的蛋白质分子

就能够在柱子上得到分离

除了大小

蛋白质的形状也对分离有影响

如果蛋白质是线性的

那么会比球状蛋白更容易

进入网孔

会导致它的洗脱时间变长

而后洗脱出来

因此

凝胶过滤层析

是根据分子的大小和形状

来分离生物分子的一种层析技术

凝胶过滤层析的特点

是非吸附性的

它的样品不结合柱子

而且只需要一种缓冲溶液就可以了

所以实验是比较简单容易操作的

凝胶过滤层析的结果

可以通过检测到的信号

来进行分析

在图谱中的横坐标是流出体积

而纵坐标是蛋白的吸收值

当没有样品流经检测器时

检测到的信号就是基线

当组分从柱后出现

被检测器检测到的讯号

就是层析峰

从进样到层析峰出现最大值时

所需要的时间是滞留时间

从层析流出的曲线上

我们可以获得很多有用的信息

首先

根据层析峰的个数

我们可以判断样品中

最少有多少个组分

一般来说

一个层析峰就代表一个组分

那么其次 根据层析峰出峰的位置

我们可以进行定性的分析

可以判断组分分子量的大小

越早出峰的组分

它的分子量就越大

第三 根据层析峰的峰高和面积

我们可以进行定量分析

峰高越高面积越大的组分

量就越多

第四 层析峰的滞留时间和峰宽

是评价这个

层析柱分离效能的依据

峰宽越窄

分离的效能就越高

最后

层析峰两峰间的距离

是评析层析柱选择性的依据

两峰分得越开

层析柱的选择性也越好

那么我们要想获得好的分离结果

我们就需要完成

凝胶过滤层析中实验的每一步

其中包括

样品的准备

平衡

上样

洗脱和再生

在这里的话我们需要注意几点

首先

我们要确认一下样品中的蛋白质分子大小

它们具有足够的差异

分子量的差别至少要在一倍以上

其次

样品我们要对它进行离心或者过滤

来去除里面不溶的杂质

避免污染凝胶柱

甚至会造成柱子的堵塞

样品的体积对实验结果

也会造成较大的影响

如果加样量过多

就会造成洗脱峰的重叠

然后影响分离效果

另外样品的浓度不能过高

浓度高会导致样品的粘性增强

而蛋白质分子的运动受限

影响流速

使得分离度差

峰形会变得宽而且矮

那样品准备好后

我们要选择合适的凝胶柱

首先是填料类型的一个选择

目前凝胶颗粒我们使用的材料

主要是将葡萄糖

或者琼脂糖

进行交联后形成的聚合物

这些聚合物它既具有亲水性

以及与蛋白质分子的相容性

可以使蛋白分子通过而不变性

又具有较高的机械强度

和化学稳定性

因此可以广泛地被用来做凝胶材料

凝胶颗粒的孔径

它决定了凝胶颗粒的分离范围

交联程度越高

孔径越小

那么分离的这个蛋白质分子的

分子量就会越小

而较大孔径的凝胶

可以用于大蛋白质分子之间的分离

因此选择合适的孔径的凝胶

很大的程度

是决定于这个目标蛋白的分子量

和杂蛋白的分子量

目前我们最受欢迎的凝胶柱的系列是

Superdex系列

它是把这个葡聚糖和琼脂糖

进行交联之后

拿到的聚合材料

那么这种聚合材料它的

分辨率是比较高的

化学稳定性比较好

其中

Superdex 30的

分离范围是在100到7000Da

可以用于多肽的分离

Superdex75它的分离范围

是在3KDa到70KDa

可以用于重组蛋白的分离

Superdex 200的分离范围是

10KDa到600ＫDa

一般适用于大蛋白和抗体的分离

在选择好凝胶的填料之后

我们还要对凝胶柱的大小进行选择

那么

凝胶柱的大小的选择主要是根据

样品量的多少以及对分辨率的要求

来进行选择的

一般来讲的话

凝胶柱的长度

比直径要对分辨率影响更大一些

柱高越长

分辨率就越高

但是我们用的凝胶柱

它的长度也不能过长

否则会引起柱子的不均一

流速过慢等等实验上的一些困难

凝胶柱的直径和长度地比

一般是在1:25－1:100之间

选择好合适的凝胶柱后

我们要用缓冲液把柱子平衡

刚才我们已经学习了

凝胶过滤的分离原理

是分子筛的作用

流动相只是起运载工具的作用

所以凝胶过滤缓冲液的选择

不是那么严格

一般来说

只要能溶解被洗脱物质

并不使其变性的缓冲液

都可以用于凝胶过滤

缓冲液也要进行离心和过滤

避免污染柱子

而且我们还要去除气泡

避免气泡会引起柱子的不均一

在我们平衡凝胶柱时

平衡体积至少要达到１个柱体积

以保证整个柱子都被平衡了

由于凝胶过滤层析

分子量的差异

主要是表现在流速的差异

流速是影响分辨率的重要参数

一般来讲

流速慢一些

样品就可以充分的与凝胶基质进行平衡

它的分离效果会更好

而当流速快的时候呢

我们不光是因为会影响到分辨率

同时流速快的时候还会导致这个柱压上升

可能会破坏凝胶颗粒的结构

因此我们设置的流速

是不能够超过凝胶柱

可以承受的最大压力

另外的话

在洗脱过程中

我们的温度要保持恒定

为了保证蛋白的稳定

我们会在冷库或层析柜里面去过柱

温度控制在４度左右

一般情况下

凝胶柱可以反复的使用

我们不必特殊的去处理

它也不影响这个分离效果

在完成过柱后呢

可以用水来洗脱掉缓冲液

再用20％乙醇进行冲洗

最后把柱子保存在20%的乙醇里

如果柱子使用时间长了

那么就会造成污染

会导致这个分离的效果下降

在这时候我们可以进行一个

对凝胶柱的深度清洗

可以依次用

30％异丙醇 水 NaOH 乙酸等

进行冲洗

来去除杂质

总结一下做凝胶过滤层析的要点

要想获得好的分离效果

主要是要提高选择性和提高柱效

那么我们可以通过选择

分辨率高的凝胶类型

Superdex来完成

而提高这个柱效

主要选择通过选择

较长的层析柱

减少加样量

降低流速等等

我们来实现这个目标

但是正如前面所讲过的

各种选择它都有一种限度的问题

那么超过这个限度

反而可能会要产生相反的一个效果

所以我们都要根据具体的实验要求来进行选择

下面我给大家举几个

凝胶过滤层析实际应用例子

第一个是凝胶过滤层析在

精细分离中的应用

在蛋白的纯化过程当中

由于浓缩或者蛋白

自身性质的原因

往往会发生聚集

因此我们可以利用凝胶过滤层析

来把蛋白的单体和聚集体分离开来

去除聚集体

最后拿到我们想要的单一的蛋白的单体

另外

我们还可以利用凝胶过滤层析

测定分子量

首先

用一系列已知分子量的标准品

放入同一个凝胶柱内

在同一条件下进行层析

记录下每一个成分

它的洗脱体积

然后我们以这个洗脱体积

对分子量的对数作图

在一定的分子量范围内

我们可以获得一条直线

那么这个就是分子量的标准曲线

在测定未知蛋白的分子量时

我们可以将

未知蛋白的样品

加在测定了标准曲线的层析柱内

进行洗脱

然后根据这个未知蛋白它的洗脱体积

在标准曲线上查出它相应的分子量

在测定分子量的时候

我们的pH值

一般要控制在6-8之间比较好

因为极端pH值容易使蛋白变性

会引起偏差

另外

膜蛋白因为需要包裹在去垢剂里面

所以对膜蛋白的一个分子量的测定

往往是不准确的

凝胶过滤层析

还可以用于组分分离

例如将蛋白质大分子溶液中

低分子量的杂质

可以用这个凝胶过滤层析的方法除去

这一个操作称为脱盐

我们还可以把样品的缓冲液

利用凝胶过滤层析来进行置换

这些操作

它对精细度的要求都不高

因此样品的体积可以比较大

可以达到柱体积的25%

而且柱长的话一般也比较短

它的柱长和这个直径的比

可以在5-15之间

在凝胶过滤层析中

也会经常遇到一些问题

比如说

蛋白分子它的洗脱延迟

层析峰的拖尾

收率低等等

针对这些问题

我在这里也给大家列出了

一些相应的解决措施

比如

蛋白洗脱延迟时

可能是因为

蛋白与填料之间有离子的相互作用

或者是有这个疏水作用引起的

相应的我们也可以通过增加盐浓度

来减少离子的相互作用

那么在有疏水作用的时候呢

我们又可以通过降低盐离子浓度

或者加入去垢剂

来减少这个疏水作用

来解决这样的问题

那么更多的关于凝胶过滤层析

它使用的技巧和问题的解决

大家可以登录AKTA纯化俱乐部

进行交流

可以获得相关的资讯

关于凝胶过滤层析的原理和方法以及应用

我们今天就讲到这里

总结一下

本节课中

大家学习了凝胶过滤层析

凝胶过滤层析的优点

它主要是分离是比较简单的

操作的参数比较少

而且操作条件比较温和

样品的回收率比较高

可以接近100％

那么我们一般用凝胶过滤层析

可以进行快速的缓冲液的置换

去除聚集体

以及对分子量和均一性进行快速的鉴定

那么凝胶过滤层析它的缺点是

样品的体积是有限的

分辨率不高

对于分子量相差不大的样品

是难以分离的

而且在分离过程中

会导致样品的一个稀释

凝胶过滤层析

它的分离的操作也是比较慢的

放大是有一定的困难

接下来

同学们会继续学习

层析方法中的亲和层析

离子交换层析和疏水层析等技术

大家需要把这些不同的技术都掌握好

灵活地应用到蛋白的纯化当中