生殖相关流式细胞分析和分选在线视频

同学们好

我是山东大学生殖医学研究中心的焦雪

今天给大家介绍的内容是

生殖相关流式细胞分析和分选

一提到流式细胞术

大家可能觉得比较神秘

是一种高大上的技术

其实流式细胞术已经出现40多年了

在免疫学 血液 肿瘤学等研究领域都起着不可或缺的作用

那么什么是流式细胞术

在我们生殖医学研究领域流式细胞术又有哪些应用呢

今天我们将进行学习

首先第一节先向大家简要介绍

流式细胞术的概念原理以及实验技巧

所谓流式细胞术（Flow Cytometry）

是利用流式细胞仪对处于快速流动的单个细胞

或生物颗粒进行多参数 定量分析或者是分选的技术

它可以检测的样本类型非常多

包括细胞 酵母 细菌 病毒等微生物

人工合成微球等不同大小的生物颗粒

根据分离目的的不同

可以分为流式细胞分析和流式细胞分选

FCM是怎么工作的呢

流式仪的构造包括液流系统

光学检测系统和电子控制系统

荧光染料标记后的单个细胞的悬液放置于流式细胞仪上

在一定的压力下鞘液会带着细胞进入到流动室

形成稳态的单细胞液流

这时经过喷嘴

水平激光与细胞垂直相交

激光照射到细胞发生散射和折射

发射出散射光

同时荧光染料被激光激发发射荧光

散射光检测器和荧光检测系统

对散射光和荧光进行收集并转换成电信号

这些电信号再经过数据化处理后输入电脑储存

这样就可以实现对细胞的分析

产生的光信号呢

可以分为两种

一种是散射光信号

另一种是荧光信号

散射光主要可以分为前向散射光和侧向散射光

前向散射光主要用于检测细胞的表面属性

反映相对大小

而侧向散射光主要检测细胞内部的结构属性

反映细胞颗粒度以及细胞器的相对复杂性

通常利用前向和侧向散射光这两种参数组合

可以区分不同大小和颗粒密度的细胞群体

去除碎片 死细胞和粘连细胞的干扰

最为经典的是外周血单个核细胞

通过FSC和SSC可以进行粒细胞

单核细胞和淋巴细胞的区分

除此之外呢 还有荧光

细胞经荧光素标记后

受激光照射得到荧光信号

那么荧光信号的强弱

反映了细胞内抗原的表达含量

使用不同荧光标记的抗体染色

可以同时检测一个细胞的多个不同特征

基于散射光和荧光信号

FCM可以检测多种细胞结构和功能参数

如细胞大小颗粒度 DNA RNA 蛋白含量

细胞表面 细胞质 胞浆核的特异性抗原

还有酶活性等等

所以 细胞内几乎所有能够被荧光染料标记的成分

或者发生的变化其实都可以用流式来检测

我们都知道组织细胞存在很大异质性

没有两个细胞是完全一样的

传统的群体细胞研究

可能会掩盖细胞间的一些生物学差异

一些重要的生物学信息很容易消失在大背景中

我们来看这个例子

这里有3个细胞构成不同的样本

我们要对某一靶蛋白的表达进行研究

我们假定 蓝色细胞不表达此蛋白

而其他细胞分别有不同的表达量

如果我们对靶蛋白进行WB分析

样本1是不表达的

但是样本2和3可能会得到相同的条带

但是通过流式细胞分析

我们很容易就可以区分每个样本的差异

并能够判断每种细胞的相对表达量

这是因为WB是检测的细胞群体的平均水平

而流式细胞术是对单个细胞特征进行分析

此外呢 相较于WB

流式是多参数多维度进行分析

只需要很少的细胞即可以实现

所以流式是具有它的优势的

首先它速度快 准确性和灵敏度高

可进行高通量检测

而且可以多参数 多荧光分析

对细胞多种特性同时进行识别

现在随着高端流式仪的研发

甚至可以同时检测近30种颜色

除了定性分析

流式还可以定量分析

更为重要的是

除了进行分析

还可以对特定性状或功能的细胞

分选以后进行后续研究

既然流式能帮助我们检测这么多参数

如何来做流式呢

首先是要有一个好的实验设计

第一要确定检测的标志物是什么

明确它的特异性 定位 属性 有没有合适的流式抗体

然后要搭配合适的荧光素标记抗体

这里要遵循基本的搭配原则

首先优先选用亮的荧光素

荧光素强度与抗原表达高低匹配

表达低的抗原可以选用较亮的荧光素

表达高的抗原可以搭配一些较弱的荧光素

还要考虑光谱重叠

尽量避免或者是减少荧光溢漏

选用的荧光素要与流式仪器相匹配

另外还要考虑某些荧光素的特性

如某些荧光素光谱较宽 或者是串联染料等等

实验设计好了就开始准备样本

我们的目标是要制备成单细胞悬液

根据样本来源不同

采用不同的制备策略

外周血我们主要分析白细胞

根据实验目的选择裂解红细胞或者提取单个核细胞

培养细胞或者是脱落的细胞比较简单

但是仍然要做好消化

对于各种实体组织

则需要进行切 剪 研磨等机械分离

和胶原酶 胰酶等的一些消化才能形成单细胞悬液

制备好单细胞之后呢

可以进行荧光染色

根据抗原在细胞内的定位

采用不同的染色策略

对于细胞表面的分子

如一些CD分子 膜蛋白可以直接染色

胞质内的蛋白

像一些细胞因子

则需要固定破细胞膜

而细胞核内的转录因子的标记需要固定破核膜

在实验过程中有些小trick我们需要注意一下

我们需要裂解红细胞 从而清除红细胞

还有些标记需要封闭Fc受体减少非特异性染色

要用染料对死细胞进行标记

排除死细胞的干扰

此外还要做好对照

包括有空白对照 阴性对照 单染对照

同型对照 荧光减一Fmo对照

这样才能保证样本的重复性和结果的可靠性

另外 操作时间尽量要短

保持细胞活性

避光染色

上机前要对细胞进行过滤防止阻塞仪器

今天这一节的课程呢

我们简要介绍了什么是流式细胞术

它的工作原理是什么

可检测的参数和它的优势

以及在流式实验中的一些小技巧

希望大家对流式能有一个初步的概念

谢谢