流式分析和分选在生殖医学研究中的应用在线视频

同学们好

上一小节我们介绍了流式的基本知识

这一节我们将介绍流式分析和分选

在生殖医学研究领域的应用

我们将从细胞功能 精子细胞结构和功能

免疫细胞表型和功能以及细胞分选

四个方面来介绍

细胞功能主要包括细胞增殖 凋亡和细胞周期的分析

细胞凋亡的过程涉及多个层面

凋亡早期会发生磷脂酰丝氨酸的外翻

线粒体膜电位降低

然后Caspase酶活化

晚期细胞膜通透性增加

发生DNA断裂

这些过程其实都可以用流式细胞术来进行检测

而细胞增殖和周期

可以通过DNA含量 CFSE示踪

BrdU掺入等等来进行评估

接下来我们举例介绍

细胞膜磷脂酰丝氨酸简称PS

它的外翻是早期凋亡的特征之一

在正常的活细胞中

PS位于细胞膜内侧

凋亡初期PS从细胞膜内侧翻转到膜表面

AnnexinV能与细胞膜外侧暴露的PS高亲和力结合

7AAD是一种核酸染料

在正常或早期凋亡细胞的细胞膜是完整的

7AAD不能透过

但是它可以穿透晚期凋亡或者是坏死细胞

与细胞内的DNA结合

那么如果用这两种染料联合分析

我们可以看到如图所示

活细胞是AnnexinV和7AAD双阴性的

早期凋亡细胞是AnnexinV阳性的

7AAD阴性的

晚期凋亡或者是坏死的细胞则是双阳群

CFSE可以穿透细胞膜

不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到胞质蛋白上

被激发产生绿色荧光

当细胞分裂增殖时

具有荧光的胞质蛋白被平均分配到两个子细胞中

荧光强度是亲代的一半

这样 在一个增殖的细胞群中

各连续代细胞的荧光强度呈递减趋势

我们利用流式细胞检测细胞荧光强度

则可以判断细胞分裂增殖的情况

细胞周期

BrdU或EDU能够在DNA合成S期掺入复制的DNA中

然后利用抗BrdU抗体进行标记

可以区分S期

显示增殖细胞

同时结合DNA染料标记总DNA

荧光强度随DNA含量变化

根据荧光强度可判断细胞处在细胞周期的哪个阶段

如果两种染料双染则可以检测

细胞在整个细胞周期中的增殖特点

如图所示

R3是G0 G1期细胞

R5是G2 M期细胞

R4是BrdU阳性的S期细胞

此外呢

我们研究中经常还会用到

荧光蛋白分析检测转染效率 蛋白表达量

流式细胞分析也是有效的检测工具

不像荧光显微镜需要固定视野下人工计数

流式可以快速 定量的检测多种荧光蛋白

并进行数据统计

简单而高效

精子细胞结构和功能分析我们主要从两大方面介绍

第一个是精子细胞DNA分析

我们都知道精子发生分为3个阶段

首先精原细胞增殖分化成初级精母细胞

含有4倍体量的DNA

初级精母细胞经第1次减数分裂成为次级精母细胞

染色体数目减半

DNA含量为2倍体

次级精母细胞经第2次减数分裂形成精子细胞

DNA含量为单倍体

然后形成精子

基于生精过程中染色质结构

DNA倍性以及细胞大小形状的变化

使用DNA染料标记后进行流式分析

可以区分不同发育阶段的细胞

那如何来实现呢

取小鼠睾丸组织可以制备单细胞悬液

然后标记Hoechst和PI染料进行流式分析

PI是用来区分死活细胞

Hoechst因为发射光谱比较宽

可以被两个通道检测

Hoechst blue代表DNA倍性变化

Red代表染色质结构变化

可以将生精细胞分为单倍体的精子细胞

2倍体的次级精母细胞

因为精原细胞较为罕见 所以数目较少

还有4倍体的初级精母细胞

并可以区分第一次减数分裂的不同时期

目前这项技术已经成功应用于小鼠模型中

雄性生殖细胞的分析和分离

为探索精子发生机制提供了有效的技术支持

精子功能分析主要包括标记CD45 CD53分析精液白细胞含量

SYBR14 PI双染检测精子质膜完整性

丫啶橙染色检测精子DNA完整性

也就是DNA碎片指数

还有线粒体膜电位

顶体完整性的检测等

这些检测在精液常规和形态学分析基础上

增加了对精子功能的评估

使传统的男性精液分析

进入了细胞分子生物学水平

流式检测精子DNA碎片指数是目前最准确快速

并且完全可重复的方法

被男性生殖遗传学检查专家共识和who标准所推荐

正常精子DNA紧密结合而具有抗酸性

可以维持双链的稳定

受损或不成熟的精子染色质松散

DNA在酸作用下变成单链

吖啶橙与双链DNA结合发出绿色荧光

与单链DNA结合发红色荧光

以此可以计算发生DNA损伤的精子比例

当比例高于30%

则预示着生育潜能低下

免疫细胞表型和功能分析包括细胞分型 表型鉴定

细胞活化 细胞因子 转录因子及功能分子等的检测

目前免疫分型的趋势是进行更多色的研究

也就是在单个细胞上标记越来越多的marker

这样可以对复杂细胞群

同时进行多种亚群的表型标记和功能评估

发现和分析罕见或者稀有细胞亚群

它的通量会更高

对样本量的需求会更少

非常适用于我们少量珍贵的生殖样本的多维度精细分析

我们在这里以母胎界面免疫细胞为例简单介绍

母胎界面是妊娠免疫耐受的基础

母体来源的蜕膜细胞和免疫细胞

以及胎儿来源的滋养层细胞相互作用维持正常妊娠

深入了解妊娠外周和母胎界面的免疫反应

可以揭示胎儿免疫耐受的机制

同时也有助于妊娠失败

先兆子痫 早产等疾病机制的探讨

和免疫调节策略的发展

看这个研究 它对比了妊娠早期外周血和蜕膜NK细胞

发现蜕膜NK细胞高表达CD49a和EOMES

可以分泌PTN 等生长因子促进胚胎的发育

下面免疫荧光的结果也证实了流式的发现

而且研究发现复发性流产患者这一NK细胞亚群数目减少

产生生长因子的能力显著下降

而这一项研究也是用流式检测妊娠早期蜕膜NK细胞

发现Tim3⁺NK细胞在早孕期特异性升高

相较于Tim3⁻NK细胞

它表达更多抗炎性细胞因子

对滋养细胞的杀伤能力降低

所以是一群具有耐受表型的NK细胞亚群

而在RSA患者和小鼠模型中

Tim3⁺NK数目减少

耐受表型和功能异常

这两项研究都通过多参数流式分析

发现了特异的免疫细胞亚群及其新的功能

并阐明了这些细胞在复发性流产致病中的作用

最后给大家介绍流式细胞分选

它是根据每个细胞的光散射和荧光特征

将特定的细胞从细胞群中逐个分选出来

又称为荧光激活细胞分选FACS

今天我们主要介绍电荷式流式细胞分选

要进行细胞分选

首先要要先制备单细胞悬液

然后对细胞进行荧光标记

上机后通过流式分析确定细胞表型

把含有目的细胞的液滴加上正 负电荷或者不同的电量

当液滴流经高压电场时

因为携带不同电荷或者电量发生不同角度的偏转

从而落入各自的收集容器

没有充电的液滴则会进入废液

从而实现细胞的分离

流式分选精确度高

速度快

分选速度可以达上万个细胞每秒

可以同时进行多个细胞亚群的分选

此外

不仅仅限于表面抗原标记

还可以根据任何能检测到的发光度如细胞体积

荧光散射度的差异来分离细胞

更为重要的是分选后的细胞还可以进行培养

小鼠注射

DNA RNA 蛋白的检测及其他高通量的研究

或者进行细胞鉴定 细胞治疗等等

近年来随着高通量组学技术的发展

流式细胞分选结合转录组 蛋白组以及单细胞测序

将细胞表型与多组学数据配对分析

从单细胞和分子水平更全面多维地挖掘细胞亚群的特征

能进一步揭示疾病致病机制的异质性

那么看两项研究分别对成年人卵巢和胎儿性腺组织

制备单细胞悬液后

进行流式分选和单细胞转录组测序

第一项研究标记7AAD

通过流式分选去除7AAD⁺的死细胞

从而确保了测序的细胞活性

第二项研究标记了CD117

通过流式分选了CD117⁺的生殖细胞和CD117⁻的体细胞

从而对相应亚群进行富集后进行测序

这项研究收集了孕早期的胎盘 子宫蜕膜和外周血

制备单细胞悬液后流式分选

研究者采用了两种形式的分选

第一种是将CD45⁺免疫细胞和CD45⁻非免疫细胞两路分选

然后混合进行10X测序

相当于人为富集了免疫细胞进行测序

第二种是对不同亚群免疫细胞更精确的分选

根据抗体组合分选出12个不同的免疫细胞亚群

相当于人为富集了比例更低的罕见细胞亚群

然后进行smart-seq单细胞测序

这样分选富集后进行测序

可以对占比低的细胞亚群也进行有效分析

此外研发发现了3群免疫调节作用不同的蜕膜NK细胞

通过更深入的流式分析验证了测序筛选的特征分子

通过流式分选这3群细胞进行了形态分析

进一步验证了测序的准确性

该研究证实了母体的免疫系统与胎盘植入之间的关系

为解决先兆子痫 流产等妊娠疾病提供了基础

因此 我们可以看到

流式分选对特异表型细胞分离和富集

是一种行之有效的技术手段

最后给大家推荐几个学习流式的网络资源

包括BD 贝克曼等网站上的各种webinar

实验工具

都会有很好的帮助

好 那这节课我们主要介绍了

生殖医学研究中用到的流式分析和分选

希望大家能灵活应用于自己的研究

让流式细胞术更好地助力于

生殖医学领域的科研工作

谢谢