个人答辩陈述在线视频

现在我代表化学系学术分委会

宣布由学术分委会主席王梅祥签署的

我们的答辩委员会组成

主席中科院化学所的

马会民研究员

委员有清华大学精仪系

欧阳证教授

北京化工大学理学院吕超教授

清华大学化学系丁明玉教授

张新荣教授 张四纯教授

李景虹教授

秘书 清华大学化学系

刘洋副教授 宣读完毕

好 那根据这个程序

我们现在就答辩开始

首先由答辩秘书来介绍一下

研究生的基本情况

王丽达同学是2006年

到2010年在吉林大学

完成了本科学习

然后2010年之后

进入清华大学直博

攻读博士学位

那么在此期间

她的课程成绩和课题

必修的课题 科研任务顺利完成

那么符合清华大学博士答辩要求

那么下面我们把更多的时间

交给各位老师

好 接下来我们就请这个

王丽达同学进行博士论文的介绍

好的 谢谢各位老师和同学

今天来参加我的毕业答辩

我叫王丽达

我的导师是李景虹教授

我今天的答辩题目是

基于功能性核酸的生物分析

及传感器研究

主要从以下五个方面来进行介绍

首先是研究背景和意义

生物传感器是一种

对目标物敏感

并将其浓度和活性信号

转化为电信号

进行检测的一种方式

它主要有分子识别元件

和信号转换部分两部分组成

因此在我这个体系里

我们能够利用功能性核酸

作为这个分子识别的元件

并通过信号扩增放大反应

然后将两者相结合

构建新型的生物分析方法

功能性核酸是指

除了作为遗传信息的载体以外

这种传统生物功能以外

具有催化活性

或者说是特异性结合能力的

一种核酸类分子

适配体和脱氧核酶 还有核酶

它们是这种

具有代表性的几种功能性核酸

适配体它能够与不同的靶物相结合

比如说蛋白质，小分子 甚至细胞

而核酶和脱氧核酶

它能够催化特定的

这种RNA或者DNA的剪切反应

因此功能性核酸

因为这些独特的特点

同时，它作为DNA比较易于修饰

可以在DNA的末端

修饰上一些电活性的物质

或者说纳米金颗粒

或者染料分子

因此能够很好的

应用在生物分析上

它应用在生物分析上

主要具有灵敏度高

选择性好 分析速度快

比较稳定 以及便于修饰

这些特点

因此我们就利用功能性核酸

作为生物传感器

它的分子识别元件

然后在信号转换方面

我们利用的是

信号扩增放大反应

它作为生物分析平台的

一些关键技术

在这些核酸分析方法中

核酸等温扩增

是一种简便 快速 高效的

核酸扩增手段

可以适用于一些PCR等

这些比较传统的方法

不能应用的一些地方

然后因此发展核酸等温扩增技术

在生物分析以及生物传感领域

具有很重要的意义

滚环扩增作为一个

比较具有代表性的

那种等温扩增反应

在生物分析方面

也有很多的应用

滚环扩增是指

就是利用一个环状的DNA为模板

然后加上DNA引物以后

在phi29 DNA 聚合酶

的作用下

产生长的重复性的RCA的产物

滚环扩增这个反应

在实物分析方面

它的领域比较宽

它能够检测到

从小分子 蛋白质

甚至于细胞内

以及细胞内的成像等

各种不同的方面

除了滚环扩增以外

还有基于脱氧核酶

和限制性内切酶的扩增

这两种扩增方法比较类似

它们都是通过

对荧光底物的剪切

然后使分子信标被剪切以后

分割成两段

然后荧光集团和淬灭集团相互分离

产生荧光信号

然后脱落的这个核酶

或者限制性内切酶

可以进入下一步的循环反应

因而形成了这个信号放大的反应

这两种信号扩增反应

都是该论文中用到的

两种信号扩增技术

因此我的论文的选题

就是利用功能性核酸的

特异性识别能力

然后把它进行一下

功能化的修饰 加入荧光

或者说是其它的一些染料的标记

结合信号放大的技术

将这三者相结合

实现了从生物小分子

到DNA 到蛋白质

甚至于细胞内

实现了一个从细胞外到细胞内的

和一个从小分子到大分子的

一个检测过程

我的研究思路就是

利用功能性核酸的

特异性识别能力

和核酸的扩增信号放大反应的特点

发展快速 灵敏 高效的

新型生物分析方法

二者相结合

主要实现了就是以下三个课题

这个是我的

主要三个研究内容

首先第一个

是基于适配体

和滚环扩增反应的传感器研究

蛋白质 众所周知

蛋白质是生命活动的主要载体

然后也是生物功能的

主要执行者

几乎所有的生理过程

都和蛋白质相关

因此蛋白质的

对于一些健康评价 疾病诊断

和药物和食品分析方面

都有非常重要的意义

在这里我主要采用了凝血酶

作为我们的标准物质进行检测

因为它是一个比较常用的模式蛋白

同时它作为一个生物活性的物质

在人体以及生理过程中

有着非常重要的作用

与一些血液疾病相关

这个是我们所建立的

传感平台

首先我们建立了

一个DNA的环状模板

在DNA的环状模板上

这个墨绿色的部位

是一个适配体

aptamer它的结合区域

它能够特异性的识别

并结合目标物

然后通过这个识别并结合

能够抑制这个RCA反应的发生

在正常的情况下

RCA反应在phi29 DNA聚合酶

存在条件下进行

产生长的RCA的重复性序列

这个长的重复性序列

也可以与PNA以及染料相结合

形成这种聚合体的结构

而这种结构在溶液中

是呈现是紫色

但是当有目标物加入的时候

由于目标物与适配体之间

强烈的这种结合作用

抑制了RCA反应的进行

因此RCA反应不能够进行的话

染料在溶液中显示的就是蓝色

因此我们通过这种颜色的变化

能够来检测体系中

蛋白质的存在与否

然后我们就是通过蛋白质

与适配体的特异性结合

来控制了反应的发生

然后同时利用了滚环扩增

作为一个信号转换

和信号放大的技术

把蛋白质存在的浓度

转换为了可以检测的

这种颜色的信号

首先验证了一下实验过程

这个胶是我们利用这个PAGE

跑的放射性胶

对这个RCA进行了放射性标记

然后对RCA的产物

利用Taq1酶

把它进行剪切

剪切成为一个monomer，dimer...

以及一系列的这种多聚体

在有凝血酶存在的条件下

由于RCA反应被抑制

因此就是没有条带的产生

也就没有RCA反应的

产物的产生

当没有凝血酶存在的条件下

可以看到有很明显的

这个RCA产物条带

因此也就有反应

有RCA反应的发生

同时我们对它的特异性进行了检测

当我们对这个目标序列的

这个凝血酶aptamer

进行突变以后

发现突变以后的这个环状模板

对蛋白质就没有控制作用

然后同时利用的这个BSA

作为一个蛋白质的控制实验

通过这个说明了

只有凝血酶

只有在适配体正确

而且完整存在的条件下

它才能够控制反应的发生

同时我们对这个DNA模板的大小

以及DNA引物所处的位置

进行了一下分析

以排除这个位置作用

对于它的影响

然后当环模板大小有50到80碱基

就是分别有10个碱基改变

然后可以测出来就是

凝血酶都能够很好的

控制这个RCA反应

然后同时我们对它的四个地方

分别加上不同的

四个位置分别加上不同的模板

发现也是只有凝血酶存在的条件下

而不管它的引物的位置在哪里

都能够很好的抑制RCA反应

因此我们通过这个体系

经过一系列的优化

然后实现了对凝血酶

和PDGF的灵敏度的检测

然后首先我们对凝血酶浓度检测

使它的那个检测限

能够达到58nM

然后同时我们对这个

DNA环状的模板

上边aptamer的区域进行替换

然后把凝血酶的适配体

改成PDGF的适配体

发现该实验同样对PDGF

有很好的这种响应性

也就是说整个体系

可以用来检测不同的蛋白质

然后当检测不同蛋白质证明以后

我们想是不是可以

把这个传感平台

扩展于更多的这个目标物

因为功能性核酸

它的目标物非常广泛

从小分子 金属离子

到核酸 蛋白质

甚至整个细胞

然后我们刚才检测的是蛋白质

因此我们在想

是不是能够把它用于小分子的检测

然后我们在第一个体系的基础上

把它进行了一个改造

引入了这个脱氧核酶

然后在体系中

它有这个荧光底物的加入

脱氧核酶它能够对荧光体物

进行剪切产生荧光

当有RCA反应的时候

RCA反应的产物

与脱氧核酶进行互补

当它的活性位点被抑制住

然后也就抑制了

这个荧光底物的剪切

也就没有荧光

我们通过这个脱氧核酶的引入

把这个signal off

转换成了signal on

然后同时利用了滚环扩增

和脱氧核酶

它们两个的双扩增的反应

然后首先我们先验证一下

是否对蛋白质有效

然后我们对凝血酶

当加入凝血酶的时候

可以看到这个荧光底物

能够很好的剪切

产生了这个剪切的这个荧光条带

但没有凝血酶的时候

也就没有这个荧光带的出现

然后下面的这个荧光图

与上面的这个胶图

是彼此对应的

因此也就证明了

它可以很好的应用于凝血酶的检测

然后我们对不同浓度的凝血酶

进行了分析

然后测出来它的线性曲线

以及它的灵敏度

在测完蛋白质以后

我们测同样测了一下它的特异性

在这里我们采用了凝血酶

以及凝血酶的类似物

前体凝血酶

然后发现只有凝血酶

才能很好的抑制这个反应

它的前体类似物

不能够抑制反应

同时我们对这个aptamer序列

也进行了突变

然后当突变的序列

也就没有这个控制反应的发生

同时我们为了检测一下

这个传感平台它的通用性

我们就利用的这个L-tyrosinemide

这个小氨基酸

酪氨酸类似物

然后对它进行一下检测

也可以同理

当它L-tyrosinemide存在的时候

然后荧光

有荧光体物它的条带出现

然后同样在下面的荧光图上中

有荧光信号强度的出现

而没有这个目标物的话

也就没有荧光强度的产生

同样我们对它测了一下

它的标准曲线

然后测到了它的标准曲线

和它的灵敏度

然后对它的特异性

也同时进行了分析

然后L-tyrosinemide它的这个类似物

是L-tyrosine

然后我们对它研究后发现

只有正确的目标物

这个小分子核苷酸

才能够对这个产生荧光

对这个整个实验有个控制作用

同样当对这个aptmer序列

进行突变以后

它是没有这个响应的

然后因此就是我们通过

这两个体系的设计

首先目标物特异性识别

并结合适配体

来抑制了这个RCA反应的发生

然后利用滚环扩增的放大作用

和信号转换作用

实现了一个可视化的检测

然后在第二个实验中

我们利用了荧光探针

以及脱氧核酶的引入

实现了signal off

到signal on的转变

同时利用DNAzyme的

高效酶切反应效率

建立了一个适用于

蛋白质和小分子的

通用的一个检测平台

然后我的第二个实验

是自我磷酸化脱氧核酶

引发的酶级联放大反应

用于GTP的分析

首先介绍一下脱氧核酶的概念

核酶和脱氧核酶

它们都是金属离子依赖型的

一系列酶

它们主要包括这几类

剪切RNA 或者剪切DNA

磷酸化酶 连接酶等

磷酸化酶是指

它们在GTP的存在条件下

可以利用GTP作为磷酸供体

实现自我的磷酸化

因为GTP在生物过程中

有非常重要的意义

它是DNA复制时

引物和转录时的四大核苷酸之一

然后同时它作为能量物质

参与了许多生化反应

比如说蛋白质的合成 糖异生

同时它是一个促进癌细胞

无限增的增殖的能量源

因此如果能够比较灵敏的检测

以及特异性的检测到GTP的话

具有十分重要的意义

所以我们想利用自我磷酸化脱氧核酶

这个特殊的脱氧核酶

来构建这样一个GTP的检测平台

首先这个DK3X是一个

自我磷酸化脱氧核酶

它在GTP存在的条件下

能够将GTP的磷酸基团

转移到DNA的5'末端

形式一个磷酸化的DNA

然后我再引入了第二个DNA链

然后形成一个双链的DNA

在λ外切酶的存在条件下

λ外切酶能够特异性的

剪切磷酸化的这个双链DNA

使这个绿色的链释放出来

然后它可以再结合

这个分子信标

然后使分子信标在内切酶的作用下

特异性的识别

使这个分子信标被剪切

剪切以后释放的这条绿色链

加入下一个循环

引起了一系列的循环放大反应

因此这是一个GTP引发的

一个荧光放大的反应

可以利用这个酶级联放大反应

用来GTP的高灵敏度的检测

首先在机理验证方面

对于这个胶图来说

第一个是代表的是marker

lane b和c是在GTP存在的条件下

有连接产物的发生

这是因为磷酸化后的DNA

它可以在连接模板链的

存在的条件下

与另一条链DNA相互连接

形成一个长链的DNA

因此当有连接产物发生的时候

就说明它这个DNA

已经成功的进行了磷酸化

所以在GTP存在的情况下

有磷酸产物的产生

证明了它成功的自我磷酸化

在没有GTP存在的条件下

没有连接产物的产生

也就没有进行磷酸化

由此可以证明

GTP很好的控制了

这个磷酸反应的发生

同时我们对整个实验体系的荧光

做了一下验证

首先在没有这个内切酶

存在的条件下

下面的c和d两条线

当加入GTP的时候

它荧光强度是有一点增加

但增加的强度不强

当我们加入这个限制性内切酶以后

可以看到它的信噪比，a和b

增加了非常多的倍数

然后可以用于很好的检测

GTP

然后由于自我磷酸化反应

是整个实验中比较关键的步骤

因此我们对它的反应时间

进行了优化

同样我们利用这个连接产物的

产生的多少

来对这个反应时间进行优化

随着反应时间的增加

这个自我磷酸化产物

它的含量逐渐增加

并在30分钟以后达到平衡

因此我们利用30分钟

作为这个自我磷酸化反应的

一个最优的条件

同时我们对反应中其他的一些

反应条件进行了优化

比如说λ外切酶

和这个内切酶的反应时间

然后选取了一个最佳的优化条件

以后对这个GTP的灵敏度

进行了检测

然后首先这个图A

是不同的GTP的荧光响应曲线

可以看到随着GTP浓度的升高

它的荧光强度也是逐渐增加

然后我们对这个图的

这个峰高进行取样

然后测出来它的标准曲线

然后实现了对GTP的检测

然后这个检测下限

大概是1μM

同样对它的特异性分析

然后再加入不同的

这个GTP ATP这几种类似物以后

发现只有GTP能够影响

荧光强度的变化

这是因为这个自我磷酸化脱氧核酶

它是一种非常特异性的酶

它只能够利用GTP的磷酸供体

来完成磷酸化

因此它具有很好的特异性

由于这个整个体系

具有很好的特异性

以及灵敏度

它就可以很好的应用

比较有潜力

并且能够应用在以后的GTP检测方面

所以说总结一下整个实验

它是首先特异性方面

是利用这个自我磷酸化脱氧核酶

利用GTP作为唯一的磷酸供体

来保证了它的特异性

同样利用酶联信号放大技术

来实现了它的高灵敏度检测

然后再基于这前面的

两个体系的基础上

我设计了第三个实验

是基于酶联催化反应

和链置换技术

用于miRNA的分析

首先miRNA的生理功能

它的一个非常重要的

短链非编码的RNA

调控了超过60%的基因表达

参与了包括细胞分裂 分化

凋亡免疫等一些重要的生理过程

它的表达异常

与许多癌症还有一些其他的

比如心血管疾病 神经性疾病相关

因此检测miRNA具有非常重要的意义

现在的生理过程

就可以将它作为标志物

实现疾病的早期诊断

或者说是对细胞内的miRNA的

表达浓度进行检测

或者说对它进行一个

细胞内的成像分析

但是miRNA的检测

面临着一些困难和挑战

第一个原因

是因为它的序列比较短

大概是21到23个碱基

第二就是因为相似程度高

像同一个家族

它miRNA大部分都是单碱基差异

比如说这里列出来的

let-7a家族

大部分都是一个

或者说是两个碱基的差异

这种碱基的差异

很难在一般的传感平台上

进行检测

其次它是低浓度

然后由于单个细胞内miRNA个数

可能小于100

浓度太低的话

就很难进行细胞内的成像检测

因此我们想设计一个

高灵敏度的高特异性的检测方法

因此我们就引入了

这个链置换的机制

链置换的机制是一个

高特异性的检测方法

它主要起源于

就是这个黏性末端

首先利用黏性末端进行识别

然后进行一个互补以后

通过分支转移的方法

然后将这个红色的DNA链

逐渐取代下来

然后使它完成了

整个链置换的过程

使这个红蓝相配对

变成了一个蓝绿相配对的方法

然后使红色的这条DNA链释放

由于这个技术

它的特点是

当有一个碱基突变的话

这个链置换技术

可能就不能进行

因此它的特异性比较强

可以检测单个碱基的差异

同时它的DNA可塑性强

可以引入功能性的DNA序列

比如说一些脱氧核酶的

或者适配体的

或者一些标记的序列

所以说链置换技术

是一个比较方便的

可以用于特异性检测的方法

然后这是之前两个体系上

所用的一些酶联信号扩增技术

首先是RCA扩增技术

然后是限制性内切酶

所介导的信号放大技术

将二者相结合

与链置换技术一起

然后构建了第三个体系

然后第三个体系

是基于级联酶催化反应

和链置换技术用于miRNA的分析

这是一个DNA自组装结构

首先我们将DNA自组装

构建了一下这个模板

然后这个H1到H5

构建成了一个

这种DNA的一个双螺旋结构

然后它有三个分支A B C

然后在ABC上

有两个锁环结构C1和C2

当miRNA加入的情况下

miRNA与第一个分支A相互结合

然后经过链取代反应

它能够把这个C1的这个末端

给置换下来

使C1的末端结合在这个部位（B）

由于C1的末端结合在这个部位（B）

它又相当于把C2的末端

给链置换下来

然后由于彼此之间

相差五个黏性末端碱基

因此他们可以通过这个miRNA

来引发整个链置换反应

然后当锁环结构形成以后

我们在T4连接酶的作用下

连接成环

然后利用RCA反应

产生大量的RCA产物

然后引入这个分子信标

和内切酶实现了一个

信号放大的技术

而在这里面主要有两个点是

第一个是实现了特异性的识别

链置换技术就是实现了

特异性的识别

第二个是利用RCA

和这个限制性内切酶

二者介导的这种二次放大反应

实现了构建了

基于miRNA的DNA纳米传感器

然后相当于利用miRNA作为燃料

来激发整个反应的进行

我们对实验进行验证以后发现

当这个首先是胶图

在lane a和b

a b是在miRNA存在的条件下

可以明显的看到

这是RCA产物的存在

c是在没有miRNA存在的条件下

没有RCA产物的产生

然后同时对它进行了一下

荧光的检测

在这里我们引入了一个

c1和c2两个环

然后当c1只存在

当只有c1存在的情况下

它的曲线是b和d

然后它的信噪比

可以看到比较低

当引入这个c2

第二个锁环结构的情况

它的信噪比

有了很大强度的增强

然后这个c2的引入比较巧妙

是因为一部分它与分支B互补

可以减少了背景的发生

然后同时在减少背景的同时

它能够同样的进行RCA反应

然后使那个荧光信号增强

所以在背景由d降到了c

然后荧光信号由b升到了a

然后利用两个锁环结构的引入

实现了它的一个

这种荧光信号的响应

然后我们对反应中

所需要的一系列酶

然后进行了一下优化

比如说T4连接酶的浓度和时间

滚环扩增所需要的 phi29 酶的

浓度和时间

以及限制性内切酶的浓度和时间

然后找到了最优化的

和最短的 最迅速的

一些反应的时间条件

在优化好时间条件以后

对let-7a进行一下灵敏度的检测

这个是在不同浓度的let-7a

存在条件下

它的荧光曲线

然后这个是对它取对数值

测标准曲线

它的检测下限为58 fM

然后线性标准是从100 fM-1 nM左右

同样我们对它的特异性

也进行了一下检测

然后红色的线是let-7a

let-7e fg

这几个都是它的同一家族的类似物

其中let-7e和let-7f

分别只有单碱基的差异

let-7g是有两个碱基的差异

可以从图中看到

当它有碱基差异的时候

它的荧光信号有明显的减弱

因此这个实验

就可以用来特异性的识别

let7家族中的let7a

然后整个实验呢

这个miRNA可以特异性的识别

并且驱动传感器

引发这个级联置换反应

然后双环结构的引入c1 c2

能够提高信噪比

在降低背景的同时

同时提高了荧光强度

然后滚环扩增和限制性内切酶的

共同作用二次扩增

保证了它的灵敏度是比较高的

通过整个实验的验证

然后实现了miRNA高特异性的

单碱基差异性的检测

因此我的整个博士论文

是基于功能性核酸

具有良好的生物分析应用前景

能够实现对不同的目标物的

高灵敏度 高特异性检测

下面是分别三个课题

第一个是利用了适配体的

特异性识别和滚环扩增

以及基于酶切的信号放大方法

构建了比色

以及荧光的两种不同的传感平台

实现了对目标物的快速准确分析

第二是使用

利用自我磷酸化脱氧核酶

它这个特异性的

以及唯一的识别GTP的特点

结合酶联信号放大反应

实现对GTP的检测

并能够有效的区别类似物

三是利用miRNA特异性

引发级联链置换反应

形成双环结构

结合滚环扩增和限制性内切酶

共同作用的二次扩增

实现了对let-7a的检测和区分

这个是目前已经发表的文章

然后这几年博士

感谢一下我的导师

李景虹教授的精心指导

然后感谢实验室的各个老师和同学

有了你们实验室才充满了欢乐

然后感谢一下化学系各位老师

对我的指导

谢谢

各位在场的老师和朋友

有什么意见请指导

谢谢