个人答辩陈述在线视频

各位老师各位同学大家下午好

非常高兴大家能够来参加

今天下午冯会娟同学

和王婷婷同学的博士生论文答辩

那么下面的话先由我来介绍一下

这次参加答辩的

答辩委员会的各位专家和老师

答辩委员会的主席

是李梢老师来自清华大学

以及北京大学的李程老师

来自中科院微生物所的

娄春波老师

来自清华大学的谢震老师

和来自清华大学的张学工老师

下面我简单介绍一下

冯会娟的个人简历

冯会娟于1989年4月

出生于河南省新密市

2007年9月考入

华中科技大学生物信息技术专业

2011年7月本科毕业

并获得工学学士学位

2011年9月免试进入

清华大学自动化系

在张学工老师的指导下

攻读控制科学与工程的

博士学位至今

在读期间完成总学分36学分

发表SCI论文两篇

其中第一作者论文两篇

学位论文的题目是

基于高通量测序研究选择性

剪接的功能和调控

下面请委员会的主席

（李梢）老师主持会议

下面请冯会娟同学

进行博士学位论文答辩

时间不超过40分钟

好的

各位老师同学大家下午好

首先非常感谢大家

能抽出时间来参加

我的博士论文答辩

我博士论文的题目是

基于高通量测序研究选择性

剪接的功能和调控

首先我今天会从以下三个方面

来给大家汇报我的工作

首先是研究背景

其次是主要的工作介绍

最后是总结和展望

首先要给大家介绍一下

为什么我们选择选择剪接性剪接进行研究

遗传物质遵循中心法则

首先从遗传物质

从DNA经过转录传递到RNA

RNA经过翻译传递到蛋白质

经遗传信息的基本单位是基因

基因由外显子和内含子

间隔排列组成

而基因通过转录形成初始的mRNA

而初始mRNA通过选择性间剪接

形成具有多种不同外显子

组成形式的转录本

而这种不同外显子

组成形式的转录本

则是由选择性剪接产生

选择性剪接

是一种重要的转录后调控机制

选择性剪接有非常重要的功能

从最基本上来说

选择性剪接能够增加转录组

编码蛋白质的复杂性和多样性

具体来讲选择性剪接

可以改变mRNA的稳定性

可以产生不同的翻译过程

而且可以改变蛋白质的性质

以及产生功能获得性和

功能缺失型的蛋白质

还可以产生

具有相反作用的蛋白质

这些蛋白质在细胞中

重要的组成部分

例如转入因子

它能够参与多种多样的细胞过程

甚至改变细胞的形态

选择性剪接除了在单基因水平

改变蛋白质的结构和性质以外

还能往往形成共剪接网络

以网络的形式

网络内的基因具有相似的剪切形式

协同完成特定的生物功能

选择性剪接功能的复杂性离不开

选择性剪接调控的复杂性

选择性剪接调控简单来说

包含一些初级的核心元件

以及辅助元件

调控选择性剪接的初级元件

包括分支位点

3’剪接位点和5’剪接位点

而调控选择性剪接的辅助元件

包括一些RNA结合蛋白

它们能够特异性的识别

位于可变外显子

以及外显子上下游的

一些特定的序列

从而识别这些序列

结合这些序列上对该外显子的

剪切起到抑制或者是促进作用

选择性剪接自1977年发现以来

得到了大量的研究

而近年来随着高通量测序技术的

发展使得选择性剪接的研究

进入了一个新阶段

其中高通量RNA测序

通过将细胞内的mRNA进行打断

提取细胞内的mRNA

并将其打断之后

对其剪接组成进行测序

而将得到的

通过高通量测序得到的读段

定位到基因组上之后

可以在选择性剪接

形成的转录本的组成

以及转录本的表达量

进行检测和定量研究

此外HITS-CLIP技术通过抓取

组织内或者细胞内

RNA结合蛋白与RNA结合的片段

也就是说能够调控

选择性剪接的序列

通过提取这些序列

并将其用高通量测序的方法

进行测序

我们将得到的读段

通过生物信息学的处理

可以在全转录组范围内定位

RNA结合蛋白和RNA结合序列

也就是调控选择性剪接的调控序列

那么选择性剪接是一种

重要的转录后调控的机制

在以前的研究上大部分对

选择性剪接对基因表达的调控

停留在基因水平

主要包括对基因表达量的估计

建立共表达的网络

以及研究基因功能

和研究基因的转录调控

但是随着基因水平研究

越来越丰富和完善

并且由于高通量测序技术的发展

使得从基因表达调控的

基因水平的研究慢慢地转向了

转录本水平的研究

这样就提出了一些新的问题

包括如何对选择性剪接进行检测

以及定量研究

如何建立转录本水平的网络

也就是共剪接网络

如何研究选择性剪接基因的功能

如何研究选择性剪接调控

然而近年来随着

HITS-CLIP和RNA测序技术的发展

有大量的研究

利用高通量测序技术

对选择性剪接的功能和调控

以及选择性剪接的网络进行研究

这里面的研究

主要可以概括为以下四大方面

第一是主要是用高通量测序技术

检测转录组中的选择性剪接事件

第二是比较样本间的剪接差异

此外还通过一些生物学的方法

研究选择性剪接的功能以及调控

特别是RNA测序数据的积累

为研究选择性剪接提供了大量的资源

然而RNA测序数据

仍然存在着一定的质量问题

如何对RNA测序数据

进行质量评估

把握数据的质量是进一步研究

选择性剪接的一个基础

然而现在目前还缺乏

对RNA测序数据质量

进行系统研究的方法

通过样本间剪接差异的比较

我们往往可以得到

大量的差异剪接基因

而对差异剪接基因的功能

缺乏单基因水平的

选择性剪接功能的分析

而这是单基因水平的

选择性剪接功能的分析

在疾病的应用中尤为的重要

此外HITS-CLIP

和RNA测序的技术结合使用

使得研究RNA结合蛋白

在选择性剪接的调控作用

得到了快速的发展

但是研究RNA结合蛋白的组合

结合多种数据研究

RNA结合蛋白的组合调控

在选择性剪接的研究应用中

仍然有一定的缺乏

而RNA结合蛋白的组合调控

在发育中尤其的重要

为此基于现在的研究现状

我们从RNA测序数据出发

首先提出了基于统计方法

mRIN评估

RNA测序数据质量的方法

其次我们建立了

选择性剪接功能的分析流程

并应用在疾病中

研究了激酶的选择性剪接

我们此外还结合了

HITS-CLIP数据

和RNA测序数据

建立了选择性剪接组合调控的

分析流程

并将其用在发育中

研究了选择性剪接

在神经发育中的调控

并对其做了应用

现在来主要简单的介绍一下

本文的研究工作

首先我们刚才提到

RNA测序数据

仍然存在着一定的质量问题

那么如何评估

RNA测序数据的质量

是目前领域中

仍然缺乏的一个问题

所以我们希望提出

基于RNA测序数据的统计方法

来评估RNA测序数据的质量

RNA测序数据中

存在着一定的3’偏差

主要体现在如果将

读段定位在基因组上之后

定位到基因上的读段

呈现一种非均匀分布的情况

在基因的3’有着大量的

读段积累

而基因的3’偏差的来源

有多个可能

但最重要的是这个3’偏差

表现了样本中RNA的降解

RNA测序数据中的3’偏差

有着重要的影响

会严重的影响基因表达的估计

如图我们可以看到

这是一组BrainSpan中脑样本的数据

而中间这些在全局上呈现

基因低表达的这些样本

它们存在着严重的RNA降解

因此我们认为

评估RNA测序数据

是后续分析的基础

现在我们急需要提出一种方法

对RNA测序数据

用一定的基于数据的方法

对RNA测序的样本进行标记

也就是能够区分

降解跟未降解的样本

对于未降解的样本

我们可以进行后续的分析

因此我们提出了一个基于

RNA测序数据的mRIN的方法

这个方法主要是对

RNA测序数据中3’偏差进行估计

首先对于每个样本中的每个基因

我们经过读段定位后可以得到

位于这个基因上所有读段的分布

我们将分布转化为累计分布

并与理想状态下

基因上应该呈现的均匀分布

进行比较

定义一个KS统计量

来量化样本中基因的3’偏差

并且我们将每个样本中

每个基因的KS统计量

以它的中位数进行平均化

得到了一个mKS举证

这里mKS举证表征样本中

基因的3’偏差

mKS越大表明

这个基因的3’偏差越严重

也就表明这个样本的

这个基因的降解越严重

我们将mKS

将样本中所有基因的mKS

进行一个取其负平均值

可以得到样本的mRIN值

mRIN值表征样本的降解程度

并且我们计算一个基因的mKS值

与所有样本中mRIN值的

相关性系数

我们定义为该基因的降解系数

其中mRIN值越小

表明样本的降解越严重

而基因的稳定系数

GIS越高

表明基因的稳定性系数越高

此外对于得到的

所有样本得到mRIN值进行一个

正态分布的估计

我们可以计算

样本降解是否显著的P值

我们将mRIN应用到刚才之前

观察到的那一组数据中

我们可以看到在全局上呈现

基因低表达的样本

它的mRIN值也都比较低

这就说明我们的方法

能够很好的区分在

区分有着严重3’偏差的样本

所以总结这部分的工作

我们提出了一个统计的方法

将RNA测序的样本进行标记

区分降解与未降解的样本

对于未降解样本

我们可以进行下一步的

选择性剪接的功能和调控的分析

所以基于以上的方法

我们将mRIN

应用在了公共的数据中

并且建立了

选择性剪接功能的分析流程

并且将其应用在疾病的研究中

目前来说对于选择性剪接

在疾病中的研究

主要的模式是这样的

对于正常和疾病的样本

往往通过差异剪接的分析

我们可以得到大量的

具有差异剪接的功能

差异剪接的基因

而对这些差异剪接的基因

目前的研究

往往是对这些基因进行

GO功能和KEGG pathway的富集分析

而缺乏单基因水平的功能分析

也就是说我们无法知道里边的

每一个基因它具体在疾病中

起什么样的作用

因此我们希望建立一个流程

从这样的一堆基因中

选取侯选基因进行功能分析

也就是建立单基因水平

选择性剪接的功能

分析流程

我们建立了这样的分析流程

首先对于得到的RNA测序数据

进行读段定位

得到的数据进行

差异表达和差异剪接的分析

并且进行功能的富集分析

对于在富集分析中得到的

差异剪接基因进行进一步的

蛋白质结构域的分析

也就是分析

那些差异剪接的外显子

它们是否富集在

具有功能的蛋白质结构域中

进一步将侯选基因

进行转录本的表达分析

我们将这个流程应用在

前列腺癌的研究中

我们采用的数据是

两组公开发表的数据

其中一组是前列腺癌组织的数据

另一组是前列腺癌细胞系的数据

其中前列腺癌病人的

这个细胞组织含30个样本

是有20个癌症组织

和10个癌旁组织

细胞系的数据包含21个前列腺癌

细胞系的数据 共58个样本

这样本都经过mRIN

对其降解程度进行了估计

经过上述的分析流程

我们发现了一个基因

基因激酶CDK5

这个基因包含了两个转录本

它包含了12个外显子

可以编码两个转录本

其中两个转录本的差别在于

这个第六号外显子

第六号外显子中包含了

一个重要的激酶的作用位点

如果这个外显子被剪切掉

那么产生的第二个转录本

就不具有激酶的功能

我们发现了这个基因CDK5

在前列腺癌的癌旁中

存在着差异剪接

也就是在癌症细胞中

CDK5选择性的表达

第一个转录本

也就是包含激酶功能的转录本

这个包含激酶功能的转录本

能够在下游磷酸化雄性激素受体

雄性激素受体是在前列腺癌中

非常重要的一个转录因子

并且促使将磷酸化的

雄性激素受体促使其往核内转运

激活其下游前列腺癌细胞的

下游的转入活性

而在正常的也就是癌旁细胞中

我们发现基因CDK5选择性的表达

第二个转录本

而失去了

对雄性激素受体的作用活性

也就是导致雄性激素受体

下游的转录活性失活

所以这一部分

我们主要的研究内容就是建立了

选择性剪接功能分析的流程

并且应用在前列腺癌的研究中

进行了差异剪接分析

并且提出CDK5的差异剪接

与雄性激素受体的作用模型

除了功能的分析以外

现在选择性剪接调控的分析

也是一个非常重要的课题

而HITS-CLIP数据和

RNA测序数据的发展

则为研究选择性剪接的调控

提供了新的技术和手段

我们将结合

HITS-CLIP和RNA测序数据

研究皮质发育中

选择性剪接的调控

我们知道大脑是人类所有组织中

所有器官中最为复杂的组织

其中选择性剪接在大脑中

尤为的广泛

而皮质发育的过程中

现在皮质发育的研究

不是一个新的研究课题

近年来有多个研究组

基于皮质发育研究了

单个RNA结合蛋白及其靶标

也就是研究皮质发育中

单个RNA结合蛋白的调控过程

但是皮质发育过程中往往是

这些RNA结合蛋白

不是以单个起作用的

而是往往以一个组合调控的机制

在皮质发育的过程中起作用

也就是说相同的外显子

可以受多个RNA结合蛋白的调控

我们在这里希望建立一个流程

来研究皮质发育过程中

RNA结合蛋白的组合调控机制

我们采用的数据是

小鼠大脑皮质发育

从胚胎前14天

到成年小鼠21个月

9个时间点共计18个

RNA测序样本的数据

并且了结合在大脑发育中

非常重要的四个剪接因子

Ptbp Nova Rbfox和Mbnl的

HITS-CLIP数据

我们建立了以下的分析流程

首先对于9个时间点的

RNA测序数据

我们用

成对差异剪接分析的方法

得到了在发育中

有动态变化的外显子

也就是有动态剪接变化的基因

对于这些

有动态剪接变化的外显子

我们基于WGCNA

基因共表达网络的方法

建立了动态剪接模块

并且对于得到的模块进行了

剪切保守性

其剪切的鲁棒性

以及功能富集的分析

最后我们基于RNA测序数据

HITS-CLIP数据

进行了皮质发育过程中

RNA结合蛋白组合

调控机制的研究

这里需要提出的是我们采用了

RNA数据HITS-CLIP数据

建立了贝叶斯网络

能够预测RNA结合蛋白的靶标RNA

这样预测的结果是

对于每个exon我们能够给出

每个RNA结合蛋白

能或者不能结合在其上

这1是表示

该RNA结合蛋白能够促进

该外显子的剪接

而-1是表示

该RNA结合蛋白能够抑制

该外显子的剪接

缺省的话代表这个RNA结合蛋白

不能够调控该外显子的剪接

将这个分析流程运用

在我们之前提到的

皮质发育的数据中

我们发现了在皮质发育中

具有四个动态的剪接模块

可以看到有模块一模块二

模块三和模块四

模块一和模块二呈现一种

在它们的外显子

随着发育时间的变化

呈现一种单调的变化

例如模块一中的这些外显子

在早期

在发育的早期它的外显子呈现

外显子被剪接掉

而随着时间的变化

它的外显子逐渐被包含

我们将分析的重点

放在两个单调变化的模块中

我们发现对于模块一

模块一中的外显子发生剧烈

剪接变化的时间点在P4与P15之间

而模块二中的外显子

则发生在P0前后

也就是出生前后

我们认为我们在发育中发现了

两个重要的模块

其中模块一是被称为

晚期发育的模块

模块二被称为早期发育的模块

对这些模块里边的基因进行功能分析

我们发现这些早期发育的模块

与神经细胞特征的形成相关

而对于晚期发育的模块

则与神经元的成熟

和神经回路的构建相关

进一步的根据贝叶斯网络推断

RNA结合蛋白的靶标的方法

我们将刚才提到的

指1和-1的指示矩阵进行可视化

然后可以看出RNA结合蛋白

对发育中模块的

一个组合调控的作用

例如可以看到在模块一中

有着Rbfox和Mbnl

这两个剪接因子的靶标的富集

而在模块二中可以看到

有Ptbp以及Rbfox这两个靶标

这两个RNA结合蛋白的靶标

靶标的富集

在这里举一个例子

我们可以看到这个基因

Gabrg2这个基因

它的9号外显子是一个在动态发

是在皮质发育中动态变化的

一个外显子

而且外显子的上下游

我们也能够看到四个剪接因子

Ptbp Nova Rbfox和Mbnl

都有它的motif的富集

并且我们将相关的

相关的RNA结合蛋白（抄除）后

也就是进行了RNA测序的

干扰实验之后

会发现该外显子的剪接

也发生了显著的变化

我们在这里发现

对于发育中的选择性剪接模块

Ptbp能够抑制

选择性剪接的成熟模式

主要的作用点在出生前后

也就是P0

而Nova Rbfox能在早期

也就是P2的早期促进发育中

成熟模式的出现

而Mbnl则在晚期促进选择性剪接

成熟模式的出现

我们考虑到皮质大脑的组织里面

有多种多样的细胞类型

而皮质发育只是其中的

一个重要的部分

那我们希望将建立的共剪接网络

应用在所有大脑的神经细胞中

以此为基础来评价神经细胞的

成熟程度

为此我们收集了公共发表的

96个数据

包含了有体外和体内

有体外体内纯化的神经细胞

以及组织细胞

并且提取其选择性剪接动态模块

以9个时间点皮质发育的

动态剪接模块为参考

建立了最近邻的学习方法

对神经细胞的成熟

程度进行预测

在这我们可以看到我们的方法

能够很好的预测

我们的方法得到的预测的实际

预测的成熟度

能够与实际的成熟程度

非常较好的吻合

但是在这可以看到

一个比较例外的样本

这个样本它的实际成熟程度

我们在这对成熟实际进行了划分

我们可以看到这个样本点

它叫嗅觉神经元简化为OSN

这个样本点它的实际成熟度为6

但是我们预测到

它的预测成熟度为1

进一步我们采用上述的分析方法

采用共剪接网络

和剪接调控的分析方法我们发现

嗅觉神经元与其他的神经元

有着显著的不同

这个不同主要体现在

嗅觉神经元在早期发育的

exons中它有一部表达

能把Nova Rbfox这两种

在神经细胞中广泛表达的

RNA结合蛋白

因此在早期发育的外显子中

这些外显子不能受到

Nova Rbfox的促进作用

它的剪接被抑制

它的剪接主要由Ptbp起作用

被抑制

而在晚期发育的外显子中

嗅觉神经元与其他神经元相同

都存在着Mbnl对它

对其剪接的一个促进作用

那么总结这部分

我们基于RNA测序数据

和HITS-CLIP数据

研究了皮质发育中

RNA结合蛋白的组合调控作用

我们发现Ptbp Rbfox Nova

和Mbnl四个RNA结合蛋白

在皮质发育的过程中

分别在不同的时期

对皮质发育中动态变化的外显子

有促进和抑制的作用

那么总结我所有的工作

我们首先基于RNA测序数据

提出了统计方法mRIN

对RNA测序数据质量进行评估

我们保留了能够经过

mRIN过滤的未降解的样本

在研究了前列腺癌中

激酶选择性剪接的功能

经过我们的流程的分析

我们提出了激酶CDK5的

差异剪接与AR相互作用的模型

此外基于RNA测序数据

和HITS-CLIP数据

我们研究了在皮质发育中

RNA结合蛋白的组合调控作用

我们发现了皮质发育中

Ptbp Rbfox Nova Mbnl四个

RNA结合蛋白的组合调控

并且还发现了

嗅觉神经元的剪接特异性

这个整个论文的创新性

可以从生物信息学角度

和生物发现的两个角度进行总结

我们在生物信息学的角度构建了

选择性剪接功能

和选择性剪接的调控的分析流程

而并将及其流程分别应用在

疾病和发育的研究中

作出了有意义的生物发现

然而本文的工作还有一定的缺陷

例如第一个工作中

我们开发的统计学方法

由于它要对样本降解程度的

给一个显著性的评估

那它对样本的数目有一定的限制

那这个限制可以通过

在大规模的搜集公开

发表的RNA测序数据

建立一个样本质量的

标准数据库来进行提高

此外我们在第二个工作中

研究了激酶与AR的相互作用

在前列腺癌中的相互作用模型

而这个模型需要进一步的

生物实验的验证

此外最后我们建立了

RNA结合蛋白的

组合调控机制的研究

而将这些研究应用在

不同神经元细胞中

我们发现了嗅觉神经元的

剪接特异性

那么进一步我们可以将研究

扩展到不同神经元亚型

之间选择性剪接的差异

这是我发表的相关论文

其中第一个方法

我们提出mRIN的统计方法

发表在Nature communications上

而且在同年被Nature Methods

作为研究亮点进行了报道

我们进行了前列腺癌的研究

投稿至RECOME-CCB

并做了短口头报告

我们最后一个工作在准备投稿

这样就是我所有的工作内容

首先我需要感谢一下

我的导师张学工教授

应该是五年前大概同一个时间

感谢张老师

给了我一个面试的机会

然后能让我

我本科学的是生物信息学

生物信息技术

然后谢谢张老师给了我这个机会

能让我跟

六年前面试

五年前

五年前入学

对 六年前 六年前

所以谢谢张老师给了我这个机会

能让我跟生物信息学再续前缘

那么还要感谢

在我的访学期间

哥伦比亚大学助理教授

张朝林老师

以及哥伦比亚大学的

研究生和博士后

Sebastian和Rachel两个同事

在第二个工作中的

颇有成效的讨论

最后还要感谢

清华大学医学院王栋老师

在第二工作中的实验方面

提供的建议和指导

我还要感谢TNlist

所有一全体的同学和老师

一直以来对我的关怀和帮助

我还要感谢国家留学基金委

提供了一个机会让我能够有幸

在哥伦比亚大学访问一年

最后感谢国家自然科学基金

然后谢谢大家