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接下来我们提问

有什么问题 包括同学都可以提问

我先问两个问题

第一个问题就是

我觉得这工作做的很好

特别是你比如说第一个工作

这个凝血酶

实际上和滚环放大的关系对吧

这就基本联系起来了

然后通过这样一个滚环放大

来测凝血酶的这个

aptamer的相互作用实际上

那么我想问你

就是说你刚才其实讲了一点

就是说如果要是这个aptamer

有一个错配的话

整个凝血酶就不能够识别了是吗

对凝血酶

就是对蛋白质检测的话

我的那个错配的碱基比较多

对 我就说假如要是有一个错配

会发生什么情况

或者一个碱基甲基化的

会发生什么情况

还有一个就是如果凝血酶的

因为凝血酶

我们知道aptamer识别

不完全是一级结构的识别

对

可能是蛋白质的二级

或者三级结构的构象的变化

假如凝血酶的构象发生了变化

那么会发生什么情况

你有没有做过

或者说有什么预测

会对你的滚环放大的松度

或者是滚环放大的反应

是不是能进行有没有什么变化

对 因为凝血酶

它就是作为蛋白质可能比较大

在空间方面

可能对这个RCA反应

有一定的阻碍作用

但是就是它的这个空间阻碍

可能在这个实验

就是在第一个实验中验证不了

因此第二个实验

我们就加入了那个小核苷酸

然后希望就是能够

通过这个小核苷酸来证明

它确实是通过aptamer

与它的强识别作用

因为可能小分子的话

它之间的空间位阻就会比较小

可以就是用来

就是消除那种怀疑

但是对于凝血酶的那个空间方面

做的可能比较少

比如说你可以通过这个扩增的速度

来测它的这个二级结构

或者是三级结构的变化

或者是通过这个速度

来测它的错配 或者是甲基化

我觉得其实都是有很多

可以深入研究的地方

这是第一个问题

第二个问题

你刚才讲到GTP的这个事情

但是我看你那个图

ATP其实是有相当大的干扰的

20%左右的干扰了是不是

那么实际应用的时候

你怎么来消除这个ATP的干扰呢

因为你刚才讲了

当然这GTP肯定是选择性很好了

对

但是从刚才那个图上看

其实ATP还是有相当大的干扰的

是

你看ATP 对吧

这个是400多的荧光强度

ATP已经差不多100了

是

所以差不多四分之一到五分之一了

也就是20%左右的干扰了

就是说你觉得有什么好办法吗

就是可能目前在我现在设计的

这个体系里面

还不能够很好的

就是只能说它们二者的荧光有差异

但是对于GTP ATP方面

就是也没有特异性的

就是太特异性的识别

可能还需要设计一下

一个新的检测方法

来对这个识别

怎么样设计 比如说两个

或者三个组分的一个组合

来把它们怎么识别起来

或者怎么样

或者就是

要不的话实际上现在

其实还是有相当大的干扰

对

然后或者说找一下

针对GTP或ATP

两者不同的那个

那个适配体或者核酶

然后通过利用不同的荧光标记

利用二者荧光强度的对比

来进行一下检测

行 我就问这两个问题

我问两个问题吧

一个问题就是

我看了就是工作做的都是

实际上就建立了三个方法论

或者三个体系吧

是

但是我就是对这个方法很好做出了

对方法也做了些评价

但是就是说都没有看到

就是说实际样品的分析

就是这个地方应该就是说

当然你重点还是建立方法

但是你做出那个方法的

就是说有效性

或者适用性的角度考虑的话

应该至少有一些体系

就是哪怕其中有一个体系

能够做一些那个就是实际样品

实际样品的检测

这种就是说就是检测

是

所以这个部分

这是因为时间关系

还是说别的什么原因没做

主要是之前一直想的是一个

建立一个新型的检测方法

可能比较注重这个理论

理论新型平台的构建方面了

对这个后续的这个实际应用方面

做的比较少

只是觉得说如果这个体系

构建成功的话

它可能有潜力应用在

实际检测方面 对

应该再做一下实际方面

然后证明一下这个体系

确实在实际方面

有这个应用价值

另外一个问题

就是你那个有一张那个PPT上面

就是说你这个地方是什么意思

就是说你是就设计的实验

来就是测定这个方法的

检测的灵敏度

或者也就是说我们通常说的

或者检测下限

对对对

还是说你那个地方

是说的

这个方法它的灵敏度高

是对某种物质一个

就是说高灵敏度的一个那个检测

但是你里面我看过好像是

你比如说是高灵敏度检测的话

那个标题就是说的

跟你那个内容就不符了

如果说是检测

你比如说就是我来测它的灵敏度

就是检测下限

那个可以说就是灵敏度的检测

或者是灵敏度的测定

那都是可以的

对

但是我觉得看了那部分以后

我就想起就是你那个

整个这个就是说

方法里面的问题

作为分析方法来讲的话

应该有一个就是说

就是检测的就是它的灵敏度

有个检测的下限

就是你这个就是说

对实际样品的应用的话

到底就是说就是有没有价值

就是说实际上要看看

就是说一般的样品

你能不能够测的出来

对

就是我测的话

我是测了一系列的

不同浓度的标准样

然后对那个

然后测了一下它的检测下限

应该是就是如果想要再进一步的话

应该是再测一下

实际样品中它的检测灵敏度

我没看过你的

没看过那个数据

对 我测的都是

就是一系列的不同浓度的标准样品

然后利用标准样品

如果说能够就是

跟其它方法相对比的话

能够高灵敏度的检测到

这个物质的话

它就是这个检测平台

有一定的优越性

但是你这个地方

就是测灵敏度

应该具体测出来一个

就是浓度的一个那个就是数值

对

它的灵敏度你能高到什么程度

检测那个就是下限浓度的

那个地方的程度

我没有写上来 应该是它

有数字

对 有数字

有数字没有写上来

这个荧光体系

它那个还有一定的背景

就是背景

你认为如何能够进一步降低

荧光的背景

老师你说的是哪个体系

就是有时候荧光出现

可以看到的话

背景相对比较高的话

就普通来说吧

不一定看你这个体系

就是说那个荧光灵敏度的提高

很大程度上取决于

这个背景是不是比较低

对

那么你认为像这些

荧光体系的话

如何进一步降低它的那个背景

就是对于荧光背景方面

就比如说第一个实验

然后因为它这个RCA反应

是一个非常重要的一个关键因素

这个下面的时间

是RCA的反应时间

但RCA反应时间过长的话

导致这个背景

它的RCA反应就是也可能会增加

因此它的背景

就是这个是就是第二个的

那个signal on的实验

就是当有目标物存在的情况下

它才有荧光的发生

但是当RCA反应比较强的时候

这个背景的斜率也是逐渐变低

然后因此我们就是通过这个背景

和这个在目标物存在条件下的荧光

二者相对比

然后在不同的时间条件下

然后寻找它有两个之间

信噪比最大的地方

对它进行检测

然后这个时候

能够保证它的就是背景比较低

同时让它的信号比较强

然后对这个也是

然后通过对这个RCA时间的优化

来寻找它的背景最低的时候

和荧光强度最强的时候

找到这个最佳的性照比

然后就是对它的反应条件

进行一系列优化

来找到那个背景最低的那个点

利用荧光的差值最大

对 荧光的差值最大

它的信噪比最大的时候

就是一个最佳的反应条件

我还是接着张老师那个问题问

就是图2.5那个

刚才我也很好奇这个图ATP那个

就是我想刚才你回答问题

我不太认同

就是说我不考虑样品

我是建立方法

实际上建立方法的目的是测样品的

对对对

就是刚才张老师问的问题

就是我先问问

就是你现在测样品里面

这几种干扰物的浓度大概多少

如果你现在统统做实际样品

没有道理的

如果你是让你的ATP

假如比GTP高 甚至比它高几倍

你这个选择实际上是没有意义的

我认为就是说你要针对样品

这个样品里面就没有ATP

就不出现那个问题了

就不干扰了

所以你选的这个干扰原则是什么

就为啥选择三种 不选择四种五种

或者是两种

我选择这三种

是因为就是GTP它的类似物

就是这三种

就是如果它们能够有

很好特异性的话

那其它一些差异性更大的

那就荧光强度差异性会更大

因此就是选了几个类似物进行

然后它们几个在这里边的浓度

都是就是是一致的 1 mM

这三种干扰物

在实际样品里面

跟GTP的浓度是一样的吗

对 是浓度是一样的

还有一个我问个题外话

就是你刚才讲总的背景的时候

我看你引用的文献全是中国人的

是不是这个课题是中国人做

外文不做 或者做的少呀

因为我留意了一下你大背景

后面基本上全是中国人的

谭蔚泓老师的

看的比较细

我想学习学习

因为是不是这个课题

就是基本上都是中国人的

我还当时扫了扫

还有其他PPT

我看中文居多

对 目前的生物传感方面

中国人做的比较多

就这个因为我们那个什么Angew JACS

做报告也提到了这个问题

就是你们做的那个东西

中国人做你就不要做了

老外不感兴趣

他说老外做不了 不太多

这个他是怎么想的我不知道

现在我也顺着提个小问题

你的工作做的非常好

我想提一个是比如说

做PCR扩增的时候

很容易出现假阳性

对

我听你这个工作很多

整个工作也是基于一个

放大反应过程

是

那么在这个过程当中

会不会也有一些

不是你需要的扩增反应发生

从而影响你

从而影响你的放大反应

就RCA反应它的假阳性比较低

因为它就是这个图

这个就是RCA的基理图

然后它就是通过这个primer

然后引起这个RCA的反应

然后这个primer

与DNA的环状模板

是完全互补的

但它不互补的话

也就没有这个反应的发生

因此就保证了它这个

对这个特异性的这个序列

进行了一下信号放大反应

换句话说就是说

你的这个扩增反应

选这个扩增反应体系

比传统的PCR扩增的

特异性要好一些

对

但是特异性好可能就是在

就是PCR还是比较

就是一个革命性的成果

RCA在某些方面

可能不如PCR

但是它的话

就是比如说就是有等温的特点

还有一些原位的特点

可以用于原位成像

这些地方可能PCR

就是暂时做不到

就原位放大

那特异性方面呢

特异性方面就是

是不是你现在选择的这个扩增

等温扩增更好一些呢

是

我问一个小问题

我也是觉得这个工作做的很好

而且非常成体系

她讲的也非常精准

我就想问一个问题

就是通常就是这个放大倍数

特别大了之后

它通常有一个问题

就是说这个动态范围

我看你这个工作

它那个就比如说凝血酶

它到了这个nM以下

50 nM

对对

然后它的这个动态范围信息

大概也是在一个order里头

那么GTP大概也是在一个order

这个如果translate

就是说我倒觉得丁老师讲的呢

就是说无论你从方法开始

一直做到那个样品

还是比较困难的 对吧

先搭个平台也是可以的

但是就是说你现在这个动态范围

能够达到了

跟以后如果去

假如去用在那个实际的

生物样品测定的的时候

你这个动态标准有什么问题

就是在这个线性度

就是我可能

就是你关注的

比如说在实际样品中

它的这个浓度动态范围

跟你现在可以达到的这个

是一个什么样的关系呢

关于实际样品方面

测的可能不太够

就是也就 就是没太测那个

没太比较二者之间的那个范围

为什么你的实际说

你的那个工作曲线的线性范围

就是一个数量级的那个范围

就是这样的实际样品的话

你比如说一个样本

不可能就是说呢

哪怕你的这是开始试探性的

你不稀释

或者我稀释两倍

那个浓度是不是正好能落到这个

就是说线性范围里面

你要不能落在那个线性范围里面

你那个没法定量

或者你定量就不准了

那个结构就不准了

这可能要对实际样品再进一步的

这个问题不是你做没做

是这个实际样品有多大需求

这个你知不知道

然后你的方法

给它转移到你做的那个范围里

就是把它应用在实际上面

对

应用到实际

实际它要求的那个浓度范围

是多大呢

你知不知道实际的要求是多少

就是这些

对于这个蛋白质检测方面

可能就是它们的浓度都比较偏高

因此就需要对实际样品

进行一下稀释

然后才利用它进行检测

这可能取决于样品

有的样品用的高呢

可能它稀释

用的低 还是不一定能测到

它不是这个样品本身

就是多高多低

但是因为它样品

不管多高多低呢

它都有一个关注的这个范围

出了这个范围就不对了

在这个范围里头

你稀释的时候

通常那个范围

就是它还是存在的

就是这个意思

并不是见得说它浓度

比如说在mM

你nM你就不能测

你是可以测的

但是它可能在mM里面

它有这么一个宽度

然后到你的纳摩

你必须也那么

它的所谓动态范围就是

必须落在这个里面才比较准确

因为如果就是在

出去的话就不准确了

对

它就无测了吧

就是这个

我换一个方式讲吧

就是说呢对于这个

就是有一点适用价值的

分析方法来讲

它的线性范围

通常至少在两到三个数量级

甚至就是说更宽

否则你的适用价值就不大

那就是你这个地方的

到底是你只在一个数量级

这个范围里面做了实验

还是说你做了很宽的这个范围

但是发现只有这一个

就是数量级在这个方面

是成线性的

我是做了一系列的浓度

然后可能也就是在下面

比较低浓度的

你那个位差图

不是几个范围

横坐标是多少

横坐标就是

你那个 右面那个

你那个 线性关系

线性关系多少

这个李老师问你就是这个意思

就是你那横坐标是几个出来的

这个的话是50 pM

到500 nM

这个用的是就是100 pM

就是是整的

也是就是100 pM到500 nM

然后它的检测限

是在270 pM

这个的话就是10 nM

因为整个这个体系的话

是500 nM

然后整个线性范围取的就是

从500 pM到10nM

然后只取的是下面低浓度的部分

我倒觉得这个方法

方法相对来说

不一定什么都好

但是就是反正就是这么一个思路

你看了一下

跟那边对比

哪一个要到 哪一个没到

放大反应是不是不一定

非得线性拟合呀

是

你看它明显着

不是个线性拟合

扩增的

你看它这挺好一个基数曲线

其实你没必要

非强求用下面那一段线性的

因为你是一个放大反应

是这样吧

所以你的那个测量范围

大大的拓宽

测准的话还得线性

那这个是

除非你那个曲线它是有重复性的

是有规律性的

那个是可以在

就是在分析化学里面

有些就是说

就是有些方法

它就是用的不是曲线

不是直线

就是用的曲线方程

那么这个

你比如说你这个曲线

让它成线性就不好

那个根据程序还有那个

秘书宣布一下这个

同行专家对论文的评议

是不是都同意通过答辩

王丽达同学这个博士答辩的论文

同行专家对学术论文的评议意见

那么都认为

一致认为达到了符合

博士答辩的这个要求同意答辩

那么今天实到答辩委员会委员七人

建议授予博士学位七人

具体结果就是这个样子

那么刚才我们通过这个

答辩委员会的无计名投票

并以认真讨论

我们形成了这个

如下的这个答辩委员会决议

我简单念一下

就是该论文以核酸作为基本工具

讲核酸适配体

脱氧核酶与信号放大技术结合

发展了系列生物分析新方法

取得创新性结果

主要有以下几个方面

一基于适配体特异性识别

滚环扩增及以酶体反应信号放大

构建了内切酶的信号关闭

比色检测和荧光检测

实现了对内切酶的快速的准确分析

第二点是利用具有自我磷酸化功能的

脱氧核酶和酶级联扩大反应

构建了GTP的荧光检测方法

GTP的高选择性检测

第三是系统研究了DNA组成结构的

miRNA的响应性能

结合链置换技术和

滚环扩增放大技术

构建了DNA的结构

实现对于肺癌相关的

高灵感度高选择性检测

该博士论文工作表明

该作者在化学相关领域

具有扎实的基础理论

和专业知识储备

且论文选题新颖 研究系统深入

具有很好的理论意义和应用价值

论文综述全面 评述认真准确

实验合理数据详实

富有逻辑论文合适规范文字通顺

是一篇优秀的博士论文

答辩时该同学语言流畅

逻辑清晰回答问题正确

答辩委员会表决

并全票同意通过论文答辩

并建议授予王丽达理学博士学位

我们祝贺

就是感谢各位老师

今天来参加我的答辩会

这几年博士期间

我也是从一个懵懂的本科生

然后到现在博士毕业

中间在李老师的教导下

以及推荐下

和清华大学的支持下

受到国家基金

国家留学基金委的那个资助

然后出国留学两年

然后再通过就是这种国际上的交流

然后学到了一些新知识

并且回国以后

李老师又给予了一些

大方向上的指导以及

并且给予参加这种国内的

各种会议的机会

然后在清华的这种帮助下

能够就是达到自己现在今天

发表一些自己想要的这种结果

然后感谢国家

以及清华的帮助

特别是感谢李老师的帮助

然后还有一些实验室的同学们

就是在他们的这种支持和鼓励下

我才能够顺利完成这个博士论文

谢谢各位老师今天来参加

我的答辩会

对于我的认可 谢谢大家