问题及答辩结果在线视频

大家有什么问题

那个你这个工作

做了很大量的辛苦的工作

我问两个问题吧

第一个问题是

你比较了转座子

和那个Cas9

对

和慢病毒这三个方法的那个

对于这个miRNA个数的容忍度

对

你能解释一下它背后的原因吗

那个慢病毒

慢病毒载体系统

这个是之前已经有研究报道认为

它的重复序列容忍度很低

它主要是由于它逆转录过程中

它的逆转录酶

它有可能遇到重复序列

会发生一种跳跃

所以这个就是

它对重复片段的容忍度比较低

是一个比较公认的一个事

然后我们这里边也进一步证实了

我们发现它的极限就是在六个

六个合成miRNA单元

对于转座子系统

和CRISPR/Cas9系统

在之前的研究中

并没有它们关于

重复序列的这种报道

我们这里边研究发现

在十八个的时候

它其实是都可以进行整合的

但是它的整合能力

就是明显的要比一两个重复序列

要有很显著的下降

可能是跟重复序列相关

也有可能是因为

整合的片段长度增加造成的

至于piggyBac转座子系统

要优于CRISPR/Cas9系统

我觉得这是由于

它们整合时候所那个

它们原理不一样造成的

CRISPR我们在这个系统里

设计的是一个定点的整合

而转座子系统

本身它是利用它的那个

转座子序列的特征

它进行的是一个多位点的整合

所以它的整合效率

是要比CRISPR系统要高的

不是多一点 是随机位点吧

对 是随机位点 对

一个细胞里面整合一个对吧

是多位点

是多位点的整合

一个上面有好多个

对

就是一个细胞里

它会发生多个

只要是跟它转座子系统的

两端的那个ITR区

可以进行重组

它就可以转座进去

是吗

对

第二个问题是

你这里面有一个概念

叫高阶相互作用

然后我知道你这个

这个两个表型

两个这个基因敲除的话

就是在来自于yeast

对对

我第一个没有看清楚

你那个ρ就是XYZ

那种一个定义

这是第一个

第二个它的物理学意义

就是生物学意义吧是什么

就是说这个高阶遗传学

高阶相互作用你怎么 是这个吗

首先是这样子的 因为在

没有定义呀这里

它的怎么算的就是ρXYZ

对

我们这个是对于它单个的

这个里边的ρXY YZ和XZ

这个是根据

表型的观测值来定义的

我们这都是一个表型

因为我们在进行的是共敲低

然后它敲低的

前面那个我知道

我说那个XYZ怎么算的

就这里边

这里边是没有算的

这个是根据实验的观测值

来定义的

首先这个是根据

实验的观测值来进行定义的

因为我们是有实验值的

我们有敲低

共敲低一个基因

这里边就是共敲低

两个基因的数据

不是ρ 我记得

这个? 这个吗

你前面 就讲的是前面这个

这个公式 对吧

对 这个在定义的时候

我们就是认为

你那个ρXYZ

也是这样的一个

三个基因敲掉了一个表型是吧

对

OK 我明白了

然后它这里边反映的生物学意义

就是在细胞里边

含有比较多的这种

基因冗余现象

它可能就是

每个基因对它的贡献

就是只是一定程度上的

然后你不进行多维的敲低之后

它们的相互作用

是展现不出来的

你说的高阶那个相互作用

对

仅仅是由于它的冗余现象

我觉得有一部分

是由于冗余性造成的吧

就是它们就是这些蛋白

可能就是它们的转录产物

然后在蛋白功能上

有一定程度上的冗余

在对于这个表型做贡献的时候

每个都是贡献的值是

如果说只是对它进行敲低之后

别的还可以替上去

我问几个问题

就是这个整个系统的工作

这个你这个敲低

就knockdown是吧

对

我不是特别懂这些事

但是你knockdown里

有没有一个程度的问题

有

就是down到一个什么程度

是有定量的这个衡量吗

我们在那个进行合成miRNA的

那个单元筛选的时候

我们尽量选择

让它敲低效率在50%以上

我们认为只有在敲低

所以就是你现在就是说认为

50%以上就算你的成功是吧

这是以前的一个实验惯例

OK

然后你后面的那个组合什么的

都是你这个

就是算就是knockdown是占50%

被knockdown

这就是就算敲了是吧

对

所以我们是要敲低 不是敲除

对 那这里边这个

大约是什么概念

就是这个成功率

就是你或者叫脱靶

或者叫什么

这个率是现在一般的技术

是个什么水平 包括你这个

是这样子的

我们这里边用的是这种敲低

然后这个敲低

一般情况下在实验的时候

都是需要进行先进行验证的

我们在这里边

就是每个就设计了8到10个

对单个基因而言

设计了8到10个

然后最终挑出来的

好的会有四五个

然后不好的

好的就是

有三个

好的你是说

我就想知道这基本的概念

就是好的是指的

你只要用这么一个miRNA

它一定是所有的基因

都会被敲低50%以上吗

不是 针对那个基因

针对特例的基因

对 就是针对那个基因

对所有的细胞我其实是

所有的细胞你这个基因都会成功

就是因为你像 CRISPR

我们没有

我们没有做到这么就是细的

是不是对于单个细胞都这样子

我们只是这么认为

那你估计

就是因为CRISPR的那个实验

不是成功率还是不高吗

对

或者你这个相对来说是当你挑

当然你那个miRNA

和那个基因是不是匹配

这是你做的

一旦匹配上以后

是不是就成功率比较高了

不是

是大约是什么概念

大约是多少的一个

我觉得也是30%到50%吧

这是一个问题

另外一个问题就是说那个表型

我可能没有跟上

你现在这个细胞

是用的什么细胞

它的表型是看的

我用的是HCT116

看得是细胞数量

对 但是

就是TNF-a处理之后

细胞的数量

但是你说其它的

如果研究各种东西的细胞

它的表型就是除了这种数量

还有些什么表型可以做的

有很多

我觉得这个要根据

具体的研究对象

你比如说他们要研究染色质的话

他们就会研究核

然后细胞的核的大小

然后形态

我觉得这个都是根据

你研究的这个东西

具体去定义的

我们这个研究的是TNF-a

它诱导的主要是凋亡坏死

然后抗炎症

所以这里边它还反映的

都是对生长状态上的影响

所以我们就选择了细胞数量

如果看大小的话是靠什么看

如果是那样的话

就不能采用我们这种实验方法

那样的话就是要对于

你做每一个敲低组合

你都做一个具体的实验

我一般情况下

那种是通过孔板的方式

然后会有一些

比较现代的仪器

比如说高内涵

它可以同时测多个细胞表型

然后你可以对它的形态

就是核的大小

然后包括它那个核的中心径

然后是什么什么样子的

这些都可以同时进行

高通量的进行扫描

然后再把这个数值

转过来具体的计算数值

那咱们这个敲

你组合的敲最多只敲17个是吧

18个

18个

就是现在这个事自动化程度

能做到什么程度

就是你要 因为你这个18个

你组合就很多了 你这可能

我们在构建多敲定文库的时候

我们并没有做那么多个

它限制因素有两个

第一个就是首先是慢病毒载体

它本身就是刚才说了

对于重复片段的容忍度比较低

如果要是再高的话

我们现在并没有找到

合适的方法进行整合

这是第一点

然后第二点就是

如果随着基因要增多的时候

然后你只是研究

比较有限的基因

然后整个组合数就会直线上升

就是说我就想问

其实是一个展望

就是你那怕不敲18个

你就敲了三五个也挺多

我们后边的敲低文库

就是敲低了五个

最终敲低了五个

这件事是自动化的

可以用自动化来做吗

在构建文库的时候

是可以借助这种

自动化的工作站来做的

就是我们前期

只需要在第一步的时候

我们要人工去做

第二步都可以

第一步是指的那个设计的是吧

不是

就是我这边有一个

文库的构建过程

构建文库的时候

对 构建文库的时候

这一步其实工作量

工作量相对来说还比较小

我们当时构建了

四万多个组合

然后它所构建的质粒

三个生物学重复加起来

是将近300个质粒

然后但是到这边

这是四万多组合

就可以借助这种

移液化工作站来做了

那这个一次能做多少

就是我就想

比如说你要挑所有的

三个基因的组合这个数

先不用说五个 已经很多了

这件事你们对多少人

多少自动化的过程

我觉得这个工作量

要是借助自动化的

并不是特别难

不是 我就想知道到底什么概念

因为我完全没有数

你是一次实验这个就

这个就要根据组合数

然后去算一下 因为

你比如说我一万个基因

它的33个组合这个相当

如果是那么多的话那就会

那就太多了

这样 所以我就想知道

你这什么你就觉得可以100个

100个是可以的

100个只做三基因的敲除

是可以的

100个你算算吧

那100万个

100个三基因组合

三基因组合没有

没有

100乘100乘100

对

我想张老师可能问你的

就是你的整个实验

不光是一个监控工作

还有后边的细胞实验

可能这个流程

它的就是最大的

比如说一个人

你能做到哪个程度

我还真没有算过

你就说你细胞实验的话

组合数太多可能就做不过来了

对 我觉得四五万个

最终的组合在四五万个

就是最终的极限了

对 我就想知道这个数

对 那就是四五万

你们那个liquid handler

就是那个液体工作站

第一个是也是用96孔板

就是96孔板操作的对吧

还是384

没有 我们都用96孔板做的

那个板里面

你们每个孔多大的体积

原来我觉得在MIT的时候

那个yingqing老说

这个会蒸发

对 我们这个里边

就发现我这里边介绍了一条

就是我里边有组合丢失

可能也是因为体积蒸发造成的

那你的体系有多大

我们当时是在十微升体系

最终的反应体系

最终反应 对

多长时间呢

就是对于就比如说这个反应

它这整个过程

然后我们要完成

一个96孔板

然后大概就是30分钟

30到40分钟一块板

那么快吗

我们加的样相对来说少

没有那么多

我们这边混合的话

就是四个质粒

就是四个质粒的话也可以

对

那你有没有注意过

那个哪些有些孔的都没东西了

我们是后来通过测序

才发现一些丢了

但是移液的时候没发现吗

移液的时候

就当时没有想到会出现这种问题

所以就没有看

这些这个我们现在

可能还需要再重复这个实验

对 我们再重复这个实验

确实是需要

因为增加那个房间里面

饱和蒸气压

然后让它蒸发的慢一些

这是世界难题

可以尝试一下 可以尝试一下

对 因为这个是需要一个

无菌的一个环境

比较洁净的一个空间

我们在那个无菌操作台

是一个是一个它一直在吹风

流动性的

那更厉害一点

对 这个更厉害

谢谢

我问一个

比较general的问题

你觉得这个领域

五年或者十年之后

会有什么样的发展

你做了这些年

你对这个它里面的问题

或者说潜在的方向比较了解

能不能谈一下

我觉得由于最近

CRISPR技术的发展

导致这个领域

出现的新东西的频率很高

然后之前就是这么多年

一直都是基于

单个基因筛选

然后双基因敲低的话

就2013年就见过这三篇文章之后

就没有报道了

但是随着CRISPR的技术发展之后

大家就转入了CRISPR

进行双敲除来构建网络

就是最近这一年

就出了好几篇文章

就是从15年到16年

然后所以说我觉得可能

就是接下来

如果CRISPR在

因为CRISPR进行的是敲除

如果说它的这种

sRNA的设计的有效性

sgRNA的设计有效性

得到提升的话

可能这个领域

我觉得会发展的比较迅速

因为如果我们要是用miRNA的话

整个你可以看出来

工作量是比较大的

对

我就说可以发展到什么程度呢

就是这个领域

就是大家现在在研究什么样的

重要问题

我觉得可能是

你预期五年十年之后

什么样的问题可以被解决

或者说能应用到

你举几个例子

然后比如说这些

都是在哪里边

有具体的应用场景

对

想一想

我觉得一个

给投资人描述一个场景

让他给你投钱

对

我觉得可以就比如说

在药物敏感性这方面

然后就是哪些药物应用之后

然后我们去筛选它的药物靶标

这个方向是一个

它可以用的一个方向

对

因为现在药物靶标

现在就是单一靶点

然后就效果不是特别好

然后就有一些

会出现耐药性 抗药性

然后如果说我们发现

一个药物可以多向

进行多个靶标

多个基因共敲低的时候

然后效果会特别好的时候

那这就是一个多靶点的药物

我们可以通过这个方式

去筛选一些药物

其它的话可能是在于

比较基础的研究上

也有一些应用

但是我并不清楚

如果在技术研究上

如果投入这么多

去研究一个技术的问题

是不是有人愿意做

因为成本还是比较高的

就我们现在

做这个实验的成本来说

不愧是到公司干过的

那么你说的高阶

是指多于个两个基因是吗

对 我们这里边定义是高于两个

刚才我没听太清楚

现在能研究到几个基因一起

我们这个

我们的实验是做了五个

但是我们在最后的实验中

然后发现的四阶和五阶的很少

可能是由于我们实验

因为存在一些组合丢失问题吧

有一定的

研究多少组 多少个组合

组合的话我们是对于

27个基因之间的两两

我看一下 我具体

27个基因是怎么选的呢

它是相同的通路

还是不太一样的通路

都是在一个通路中

但是它的功能不一样

都是TNF-a, NF-kb

对

对

就是比如说这五个之间的

两两相互作用

那其实只是一个组合

这六个里边的其中五个

那就是五个

然后可能大概

五个之间的相互作用

我们本来候选的

可能就是几十个吧

那你理解现在这个相互作用

它一般是什么样的生物机制

导致的相互作用

我觉得可能

比如说它们是一个调控

它们是上下游关系

还是说它们是复合体

因为我们这个里边研究的它是

它这个表型是相当于

它这些不同基因

共同作用的结果

它这些基因我觉得可能

可能第一就是它们

就比如说像NF-kb这边

它是抗炎症的

然后这些是凋亡的

它们之间就是在同时

有这样的一个环境压力下

它们每一个基因

对于这种表型的贡献

其实是不一样的

然后当它进行共敲低的时候

其实有基因之间的

相互的一个

就是一个平衡的问题

最终使细胞

展现了这样的一个表型

对 那你那就是相互作用

是基于表型

依赖于表型的定义了是吗

对

表型可能也有不同的层次

比如细胞层面的或者说

对

第一个层面

即使细胞层面

可能也有的是生长的

有的是凋亡的

对

这种网络都是有它

环境的特异性的

就这两个基因

可能对某一个表型有相互作用

但是

对于别的表型可能就没有

那我再问就是

就是你觉得这个

合成生物学这个

整个这个领域

你这个是和它是什么关系

合成生物学

就是你这个和合成生物学

是什么样的关系

你的工作

在这个合成生物学这个领域里

扮演什么角色

我觉得我的前一部分工作

它里边是利用了一些

合成生物学的理念

就是如何把其中的元件

进行模块化的研究

但是整个的实验过程

它其实是为生物信息学的

这种高通量研究

提供了一个技术手段

可能里边涉及到的

合成生物学的东西并没有那么多

那你这些hairpin

能在一些合成学的领域应用吗

你觉得有没有 有没有想法

就是你的这些

合成miRNA簇

我觉得是可以用的

是可以在

就是通过这种加工出来的这些

就是因为我们对于它的

它的加工都已经

就是可以通过这种

它的表达载体

进行一个比较明确的

它加工出来的成熟miRNA

是一个什么样子的

然后我们可以利用这种方法

然后做一些合成生物学中的

一些调控的

就是人为添加的一些调控元件

我替你回答你这里面

合成生物学有什么用

我觉得你这个很好的诠释了

就是build-to-understand

你通过构建

或者说presentation

去理解这个

比如说这NF-kb这个network

这是一个方面

另外一个方面

就是你实际上就是对它的模块

你刚才说了刻画

但是刻画这个

刻画完了我怎么感觉又退回去了

就是说你回到你有一个片子说

大概四种吧miRNA

但是你测试了之后

最后又选了original的那个是吧

对 有13种

原因是什么呢

我也不是 就是具体的

具体的它更深层的原因

我们并没有想

就是没有研究它的机理

但是我们只能说

我通过这种设计

然后进行实验验证

发现我们的设计

可能方法还是存在一定的局限性

你设计了啥 设计了那个

就是根据它的

这是original的序列

我们对于就是

采用了一些

就是这是比较典型的这种

miRNA前体的骨架

然后这种就是

在不改变它二级结构的情况下

做的一些优化

像这种就是它的

对它的loop做一些改变

但是都没有得到特别好的

我觉得这个原因可能是有

别跟我说那个太好的词叫优化

对 改造改造 我说错了 改造

不是 你也别那个

就是你的原则是什么

就是有什么文献支持你

做这个改动或者

首先你为什么做这个事

对 为什么做这个事

然后辛辛苦苦做了一大圈

然后又回到原来

是这样子的

我们做这个实验的最初的原因

就是有两个方面

第一方面想看它的表达

能不能得到一个提高

这是一个原因

第二个就是因为

我们想降低这种

合成miRNA单元

在整个合成miRNA 簇中的重复性

所以就是那个

重复序列太长是吧

对

我们改造的时候

然后一般情况下认为

它的就是miRNA的二级结构

是影响它加工的

一个重要的地方

比如说它这些环

是它用来结合Drosha的

这个后边的这个末端环

那你后边那些怎么敲的呢

后边

就是M3 M4 M12 M13

就是你怎么设计的

就是设计的时候

就是遵循文献已经发表的

就是合成

再遵循它的二级结构不变

就比如说这些我们可以看到

它的结构和这结构都是类似的

它是有相似的二级结构

然后或者说比较经典的

这种miRNA的

就是加工的结构

它是来自于别的

别的

别的那个细胞呢还是就是这个

不是 这是人为改的

别人人为改的

就是我人为改的

然后大部分都是有效果是吧

大部分都是有效果

但是没有比天然的更好

像这些它是它这一些

然后它是有一定的敲低效果的

然后但是它的表达量上

它就是比

就比如说M1 M2

然后它的敲低效率

看到是差不多的

但是它的表达量

就会比它要低个四倍

也就是说这些

其实你修改这些也是可以用的

对

但是它那个表达要低一些

比如说有些实验过程中

需要用到不重复的这些结构

把它给从这里边挑一些

对 这个也是我们当时做这个的目的

那你这个就是…

一个很核心的

虽然你又回到那个原始的设计了

好 谢谢老师

好

我呢就问就是两个小问题

当然也就是说建议

就是说那个

因为我觉得做了很多工作

那么第一个就是说

因为你说是遗传相互网络是吧

对

你这个网络画了没有

没有 因为我们觉得

这个实验结果就是初步出来的

还有一点早

我们想再重复一下实验

现在在重复实验

行行

完了之后网络

反正就是做出来以后

到时候我们也可以跟那个

蛋白质相互网络

什么信号通路那种比较一下

或者那些文献新的发现

新的发现

然后我看到你这里面

就是说对于新发现的

新的遗传相互作用

你打算就是设计的实验

进一步说明验证是吧

对

那你比如说你要做验证的

大概都设计了什么实验来验证

我们是这样子的

因为这些基因就是

它其实就是抗炎症

然后凋亡和坏死

我们想通过就是

因为这里边在做这种筛选的时候

是混在一起做的

我们当初是把这些

共敲低的这些细胞株单独

就是单独构建之后

然后通过那种

就是对它进行染色

然后看它的凋亡就是它

因为我们最终的表型

是一个混合的表型

就是细胞数量

我们想最终确定这些

新的高阶这种作用它是在

它是发现的是凋亡减少还是增加

或者坏死减少或者增加

然后通过流式

然后抗原抗体这种

染色实验来进行验证

就是从另一个层面上

高阶遗传相互作用

你们在做高阶遗传相互作用的验证时

我觉得有一个就是

有一个简单的建议

你们可以看一看

就是说因为你这里边

就算你刚才说的

高阶相互作用

实际上是有多种

突变背景下的一个

比如说五阶的

它可以三个突变背景下的

一个双突变对吧

对

那么现在确实是

现在的临床上面什么肿瘤

正在发生了

它都是病人里面

它都是多个突变都存在的

是吧

所以说实际上你用的细胞系

HCT116或者说别的细胞系

它也是本身就是

都是有一个突变在那里

所以说到时候

你的那个设计的时候

你可以把那个细胞系

本身的那种突变

或者是NF-kb通路

我们可以把细胞

进行一个测序看一下那个

对 应该细胞本身它也是混合的

因为现在存在很多肿瘤其实都是混合突变的

所以说它这个对以后

就是无论是研究这个疾病的机制

或者药物干预

都涉及这个问题是吧

你也可以把你们发现的这个

多种的突变的情况

看一下哪些肿瘤里边

这种突变的情况比较多是吧

这个都可以

这是说建议

其实我觉得你还是工作量很大的

好 谢谢老师的建议

那这个其它的老师的建议 有没有

没有

如果那个没有的话

那就王婷婷同学的

博士学位论文答辩就先到这里

谢谢

谢谢老师

好 下面宣读王婷婷同学的

答辩委员会决议书

高通量基因沉默技术

是研究基因遗传相互作用的重要工具

也是近年来的研究热点

该论文围绕哺乳动物细胞

miRNA簇多敲低方法

开展了合成生物学

与生物信息学研究

选题具有重要理论意义

和应用前景

论文取得以下创新性成果

一研究了含有多达18个

miRNA的合成

miRNA簇表达特征

发现合成miRNA簇中

每个miRNA可以独立表达

并且无明显位置效应

确定了该多敲低技术

适合于构建多敲低文库

二基于DNA分子

快速无痕组装技术

建立了可用于组装

2至18个合成miRNA的

层级golden-gate组装方法

并建立了多敲低文库的建库方法

三建立基于

建立多基因共敲低实验中

遗传相互作用的计算方法

发现TNFα信号通路中的

若干高阶相互作用

论文结构合理 逻辑性强

答辩过程思路清晰

回答问题准确

论文工作表明

该生在本门学科上

掌握了坚实宽广的理论基础

和系统深入的专门知识

具有独立从事

科学研究工作的能力

答辩委员会经无记名投票

一致同意王婷婷同学

通过博士论文答辩

并建议授予其

工学博士学位

一致同意推荐为

清华大学优秀博士学位论文

祝贺你 祝贺你 祝贺你