酶免疫试验（下）在线视频

大家好今天我们继续讲述酶免疫试验

酶联免疫斑点试验

从单细胞水平检测

分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞的检测技术

目前主要用于细胞因子分泌细胞的定量测定 

它的基本原理就是

从96孔微孔板底部覆盖PVDF膜

膜上包被特异性单克隆抗体

然后加入待检细胞

比如说PBMC

和抗原刺激物进行培养

细胞受到抗原刺激后分泌细胞因子

被膜上的抗体捕获

洗涤微孔板中的细胞

与生物素标记的抗体

再与酶标链霉亲和素结合

膜特异性抗体

细胞因子生物素标记抗体

酶标链霉亲和素复合物

加入显色底物

酶催化底物产生不溶性色素

就近沉淀在局部的膜上形成斑点

与ELISA差别有哪些呢

ELISA通过显色反应

在酶标仪上测定吸光度

与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量

ELISPOT通过显色反应

在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上

显现清晰可辨的斑点

可直接在显微镜下人工计数斑点

或者通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数

1个斑点代表一个细胞

由于是单细胞水平检测

ELISPOT比ELISA更灵敏

能从20-30万个细胞中检出1个

分泌该蛋白的细胞

那么报告举例

这份报告就是ELISPOT的报告

临床通常在抗酸图片染色

PCR检测痰液中的TB-DNA后结果为阴性的话

但是患者又有结核的相关症状的话

临床医生会在第一时间

考虑做这个ELISPOT检测

那么发光酶免疫试验

分为化学发光酶免疫试验

和荧光酶免疫试验 

它的原理就是

将高灵敏度的发光测定技术

于高特异性的酶免疫分析技术相结合

用于检测微量物质的新型标记免疫测定技术

用参与某一发光反应的酶来标记抗体或者抗原

在抗原-抗体反应后加入发光底物

酶催化和分解底物发光

由光检测仪检测发光强度

最后通过标准曲线计算出被测物质的含量

方法是

常用于大分子抗原检测的双抗体夹心法

及用于抗体检测的双抗原夹心法等

参与催化反应的酶标记抗体或者抗原

加入发光底物酶催化底物发光

检测发光强度

根据标准曲线计算浓度 

常用的标记酶有

辣根过氧化酶碱性磷酸酶

那么酶免疫试验的临床应用 

我们来看一下

均相酶免疫试验的临床试验有哪些呢

第一个吗啡检测

本品用吗啡-BSA结合物

和抗鼠lgG抗体分别固定于硝酸纤维膜

以胶体金标记抗吗啡抗体

采用纳米胶体金技术

应用免疫竞争抑制反应的原理

洋地黄类药物

临床主要用于充血性心力衰竭

控制快速心房颤动

但是治疗量与中毒量接近

安全范围窄

长期使用会发生中毒反应

临床需要实时监测

酶联免疫吸附试验

临床应用非常广泛

常用于临床疾病血液

及其它体液标志物的定性检测

那么一搜索CNKI

大量的相关文章就会出来

临床最常见的例子就是

乙型肝炎表面抗原检测

从图可以看出来结果

加了终止液后

显黄色为阳性无色为阴性结果

酶联免疫斑点试验

结核菌感染目前有许多种方法

抗酸染色培养PCR等方法

常规诊断的金标准是病原学检查

细菌培养

但是由于结核杆菌生长非常缓慢

一般2-4周才会可见菌落生长

当临床医生不能准确判断结核杆菌自然感染

和卡介苗接种阳性的结果时候

或当患者PPD试验阴性临床结合病史

影像学检查等综合分析

不能除外结核病的存在时

ELISPOT可以作为一个重要的辅助诊断工具

所以在临床实际工作中

将ELISPOT和PPD相结合

应是我国目前较为合理经济的

结核病诊断流程

那么发光酶免疫试验

主要用于标本中微量物质的检测

如甲状腺激素肾上腺激素

感染性疾病心脏标志

肌钙蛋白肌红蛋白等

它的灵敏度高线性范围宽

系统测试速度快影响因素小

那么影响酶免疫试验的主要因素呢 

让我们看一下

首先试剂盒原材料因素

试剂盒原材料因素有哪些呢

抗原或抗体的选择

抗原的纯度决定了测定的特异性

而方法是否能完全检出存在的特异性抗体

则取决于抗原决定簇的完整性

例如HCV具有7个功能区即核心

E1E2/NS1 NS2 NS3 NS4 NS5

而目前的临床商品试剂的HCV基因重组

抗原多只含核心

NS3NS4和NS5功能区

用此类基因重组抗原建立的免疫方法

来测定HCV相应抗体

难免在测定敏感上有缺陷

抗体特异性决定了整个测定方法的特异性

抗体的亲和力

制约着测定方法的灵敏度和检测下限

固相载体及酶结合物的选择

良好的聚苯乙烯ELISA板吸附性能好

空白值低孔底透明度高

各板之间或同一板各孔之间性能相近空间差小

酶结合物物质量的好坏也会影响检测结果的判定

那么另外一个标本因素

标本因素主要是内源性因素

一般包括内风湿因子异嗜性抗体

医源性诱导的抗鼠Ig抗体

嗜靶抗原的自身抗体

补体溶菌酶及交叉反应物质等

常采用稀释标本的方式

使得内源性干扰因素降到最低

实验室环境因素

如果温度变化过大

弱阳性标本可能检测不出来

试验仪器温度过高过低

就会让仪器的性能变差

第四个操作因素

操作因素一个是试剂准备

临床试验的时候

标本拿出冰箱后通常需要平衡20-30分钟

到室温后再使用

第二个加样本及反应试剂

微量加样器需要定期校准

保证加样的准确性

保证液体不可溅出或产生气泡

手工操作滴加试剂时

注意滴加的角度和速度

以免引起非特异性背景

在温育的时候

温育时切记注意

起始时间

从微孔板放入水浴箱后到370℃时开始

在洗涤的时候

按照要求去除反应体系中与反应无关的成分

显色

在显色的环节

为了使得弱阳性标本有充分的显色时间

建议显色20-30分钟

在比色的时候

切记要注意不同底物酶标仪的波长不同

在结果判定的环节

尤其要注意ELISA灰区的标本

出现这种原因跟温度

操作标本溶血内源性干扰等因素引起

结果判定严格按照试剂盒提供的阳性判定值进行

本节小结

本节讲授了酶联免疫斑点试验

发光酶免疫试验的原理及方法

酶联免疫吸附试验的临床应用影响因素等

谢谢大家