数据的显示与分析在线视频

大家好

上节我们讲了第一节

流式细胞分析原理

那么接下来我们今天一起学习

第二节数据的显示与分析

流式细胞的信号如何检测的

怀着这个疑问

我们来详细了解一下

今天的第一个问题

流式细胞信号检测

流式细胞仪检测信号分两类

散射光信号和荧光信号

散射光信号是指不依赖任何荧光染料

可在细胞未受任何损伤的情况下检测

并能提供大量信息

而荧光信号则是由

激光激发标记的荧光染料

载体转染的荧光蛋白或细胞自身发出

反映细胞生物学特性

那我们要问

散射光是如何检测的呢

接下来我们看看

散射光的测定

散射光分为前向散射光和侧向散射光

这张图中我们可以看出

前向散射光

简称FSC

是沿与细胞切线方向小角度散射光

反映了细胞形状和体积大小

信号强弱与细胞体积大小成正比

前向散射光不受细胞荧光染色的影响

常用于免疫表型分析的信号处理

这张图很好地诠释了

前向散射光

是如何反映细胞的形状和体积大小的

那侧向散射光又是用来检测细胞什么结构的呢

从这张图我们也可以看出

侧向散射光

简称SSC

是指激光照射细胞内容物

可以产生的方向不同和强弱不等的散射光

而垂直方向散射光对细胞膜

胞质

核膜的折射率更为敏感

可提供细胞内的精细结构

和颗粒性质的信息

SSC与被测细胞的颗粒密度和内部结构有关

用于检测细胞内部结构属性

这张图很好的诠释了

侧向散射光是如何反应细胞内的

精细结构和颗粒性质的信息

而讲到

荧光测量

我们首先要了解一下

荧光信号测量与放大器

荧光信号测量与放大器

常使用线性和对数放大器

线性放大器对信号的输出与输入是线性关系

输入信号放大几倍

输出信号也放大几倍

对数放大器对信号的输入与输出

是10的对数关系

可以对信号足够放大

适用于SSC和强度变化范围大且复杂的荧光信号

这张图反映了通过荧光检测器和散射光检测器

来检测不同种类的细胞的大致过程

从这张图我们可以看出

在流式细胞分析仪检测的过程中

有些荧光素的波长存在着重叠现象

那么问题就出来了

流式细胞分析仪检测过程中

会不会在检测器之间存在着渗漏现象呢

怎么办

那么接下来我们就要讲到

荧光补偿这个名次了

荧光补偿是指修正荧光光学信号

在探测器之间相互渗漏并被数字化检测的过程

因为流式荧光素

在相应激光激发后发射的荧光波长

并不是完全集中于一个很小的范围

一般在100nm-200nm之间

多个荧光素之间波长存在重叠

因此一种荧光染料往往可以被2个荧光通道检测到

保证了检测结果准确性

检测器检测了荧光和散射光

那么数据到底是怎么显示给我们的呢

那么接下来我们来看看

数据显示方式有哪些呢

主要有三种

第一种参数

就是FS

SS

还有FL

第二数据显示方式有

单参数直方图

双参数散点图

二维登高图

假三维等高图

三参数散点图

设门分析技术

FSC:反映颗粒的大小

而SSC:反映颗粒的内部结构复杂程度

FL

反映颗粒被染上的荧光数量多少

那么我们首先来看看

单参数直方图

单参数直方图是由一维参数

即散射光或荧光

与颗粒计数构成

反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少

处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值

而且具有相同的信号密度

仅需要观察某个荧光强度的变化

即可用于定性分析

又可用于定量分析

这张图就是单参数直方图

横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值

单位是道数

也可是线性的

对数的

纵坐标表示细胞数

根据阴性对照设定适当的门

这个叫做直线门

仪器就会给出测定值

包括阳性细胞百分率和平均荧光强度

这个就是单参数

单参数直方图大家大致了解了

那么我们来看看双参数直方图是什么样的

双参数直方图又分为二维点图

二维等高图

我们首先来看看这张标注非常清楚的图

外周血全血二维点图

这张图很清楚地看到了不同位置的中性粒细胞

单核细胞和淋巴细胞的参数

双参数信号通常采用的是对数值

其横坐标和纵坐标分别表示

与被测的细胞相关的两个独立参数

更能直观地反映具有

某些特征的细胞的分布状况和集中的趋势

而另外一种双参数图

二维等高图则类似于地图上的等高线

从图中大家可以观察到这一点

其中每一条连续曲线表示具有相同的细胞数

曲线层次所处的位置越趋近于图形中央

其所代表的细胞数越多

等高线越密集

表示细胞变化概率越大

讲完了单参数和双参数图

我们来看看这张图多维参数的显示

首先我们看看

假三维图是利用计算机技术对

二维等高图的一种视觉直观的表现方法

是把原二维图中的隐坐标非实质参数细胞数

同时显现

但参数维图可以通过旋转

倾斜等操作

以便多方位的观察结构和细节

这张很漂亮的很立体的图就是多维参数的第二种

三参数点图

图中四种不同颜色的细胞分布在不同的位置

三维坐标均为实质性参数

散射光或荧光

如X轴显示的是被检细胞所表达的

某两种分子的荧光强度

而Z轴显示细胞复杂度的参数

其更直观地显示了不同细胞群体的细胞大小

内部复杂度和相对荧光强度等更多的生物学信息

这张图显示的就更复杂了

三参数以上的显示

多种荧光抗体标记的细胞在流式细胞仪上

可获得散射光和多种荧光信号

充分展示各个参数之间的相关关系

通过设门技术

采用多个双参数图或单参数直方图组合

展示参数之间的关系

前面无数次提到了门这个名词

那么门到底是什么呢

是我们日常生活中家里的门吗

接下来我们来学习流式细胞分析仪检测细胞后

分析数据时的

设门分析技术

指在某一张选定参数的直方图上

根据该图的细胞群分布

选定其中想要分析的特定细胞群

并要求该样本所有其它参数组合的直方图

只体现这群细胞的分布情况

根据门的形状又分为线性门

矩形门

圆形门

多边形门

任意形状门和十字门

这张图就是单参数直方图中的常见的线性门的设置

这张图展示了在淋巴细胞亚群周围设的矩形门

以单独分析或分选该亚群细胞

从这张图可以看出来

十字门分析时

可以由四个区域构成

即G=D1+D2+D3+D4

D1：CD4+/CD3-

D2：CD4+/CD3+

D3：CD4-/CD3-

D4：CD4-/CD3+

这里还有强调一个概念

Region设置

就是指区域设置

区域和门是两个相关的概念

门常常与区域对应

但在逻辑设门分析中门和区并不对应

这些数据显示方式分析得差不多了

接下来我们看看

荧光染料标记染色

荧光信号是怎么来的呢

首先我们得用用荧光标记抗体

接下来抗体特异性结合细胞上对应的抗原

然后表达该抗原的细胞被标记上荧光

抗原表达多的细胞荧光强度强

最后检测出阳性细胞百分比或浓度及靶蛋白浓度

图中黄绿色抗体用的荧光染料是异硫氰酸荧光素

橙色的抗体用的染料是藻红蛋白荧光素

红色的抗体用的是藻青蛋白染料

这幅图展示了激光检测器

检测到的不同颜色的荧光强度

黄绿色的异硫氰酸荧光素

粉红色的德州红

红色的藻胆蛋白类的PE

PC

APC

还有红色的能量传递复合染料

指的是利用荧光共振能量转移技术

合成的荧光染料

这张图大家可以看看

了解一下

常用荧光染料及特点

异硫氰酸荧光素荧光颜色为黄绿色

易溶于水

与抗体结合不影响特异性

是非常常用的一种荧光素

藻红蛋白

藻青蛋白

因为消光系数和量子产额高

也是被临床和科研常用的荧光素

而能传递复合染料因为价格昂贵目前用的比较少

这一节数据分析与显示

讲述了流式细胞的信号是用什么样的方式如何检测的

数据显示参数的单参数

双参数

多参数的显示方式和解读

不同的数据如何设门的技术分析

还有荧光染料的种类和标记染色

这一节到此结束

谢谢大家