淋巴及其它免疫细胞功能检测技术在线视频

大家好

我们来学习第四节

淋巴及其它免疫细胞功能检测技术

首先我们来回忆一下之前学习过的内容

淋巴细胞主要包括哪几种

有负责细胞免疫功能的T细胞

有负责体液免疫功能的B细胞

有在非特异性免疫中起主要作用的NK细胞

我们先来学习T细胞功能的检测

从大体来说T淋巴细胞功能试验分为

体内试验和体外试验

体外试验主要包括

T细胞增殖试验

抗原特异性T细胞增殖试验

MHC-肽四聚体技术

T细胞分泌功能测定

T细胞介导的细胞毒试验

T细胞增殖试验

又称T细胞转化试验

如图所示

T细胞在体外经某种物质刺激

细胞代谢和形态相继变化

在24-48h细胞内蛋白质和核酸的合成增加

产生一系列增殖的变化

如细胞变化 细胞浆变大

出现空泡 核仁明显

核染色质疏松等

由淋巴细胞转变为淋巴母细胞

因此

这种淋巴细胞增殖又叫淋巴细胞转化

可以根据这种变化

判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性

和功能状态

非抗原性刺激物主要有植物血凝素

刀豆素A 美洲商陆 脂多糖

习惯称为促有丝分裂原

其中LPS刺激B细胞

PWM可刺激T和B细胞

PHA和ConA刺激T细胞增殖

抗原性刺激物主要有结核菌素

葡萄球菌毒素 破伤风类毒素

链球菌激酶 肿瘤抗原

同种异型组织抗原等

检测T细胞增殖反应的试验

主要有形态学法

放射性核素法和比色法三种

形态法其原则是将外周血液或分离的单个细胞

与适量的植物血凝素混合

置37℃培养72h

取培养细胞作涂片染色镜检

根据细胞的大小

核与胞浆的比例

胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征

分别计数淋巴母细胞

过渡性母细胞

和核有丝分裂相以及成熟的小淋巴细胞

以前三者为转化细胞

每份标本计数200个细胞

计算转化率

在镜下我们可以通过以下这几方面来判断

淋巴细胞是否转化

可以观察淋巴细胞的细胞大小

核大小 染色质 核仁

有丝分裂 胞质 着色

浆内空泡和伪足来判断

如图所示就是转化的淋巴细胞形态

正常人的T细胞转化率为60％-80％

小于50％为降低

形态学方法简便易行

适合基层实验室开展

但是判断结果容易受主观因素影响

重复性和准确性比较差

胸腺嘧啶核苷掺入法

T细胞在有丝分裂原或抗原的刺激下

转化为淋巴母细胞的过程中 DNA合成增加

转化程度与DNA合成呈正相关

由于存在放射性核素污染的问题

临床使用比较少

大家课后了解就可以

第三种是MTT比色法

是一种检测细胞存活和生长的方法

其检测原理为

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶

能使外源性MTT还原为

水不溶性的蓝紫色结晶甲臜

并沉积在细胞中

而死细胞无此功能

优点是

操作简便 无放射性核素

缺点是敏感性不及放射性核素法

临床上使用最多的是这种方法

第二种体外试验是

抗原特异性T细胞增值试验

在感染性疾病中

T细胞会形成对病原微生物的免疫记忆

在体外分离到T细胞后

培养增殖T细胞的同时

加入相应病原的特异抗原进行刺激

激活该细胞的记忆

有记忆的细胞会分泌γ-干扰素

通过检测γ-干扰素的量

可以反映T细胞情况

第三种体外试验是

MHC-肽四聚体技术

通过TCR与MHC-肽的特异性相互作用来检测

抗原特异的T细胞

可以了解机体的免疫状况

第四种体外试验是

T细胞分泌功能测定

主要是用免疫学

细胞生物学及分子生物学技术

分别检测细胞因子含量

生物学活性或基因表达水平

第五种体外试验是

T细胞介导的细胞毒试验

T细胞介导的细胞毒性是毒性T细胞的特性

凡致敏的T细胞再次遇相应靶细胞抗原

可表现出对靶细胞的破坏和溶解作用

它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标

特别是测定肿瘤患者

CTL杀伤肿瘤细胞的能力

常作为判断预后和观察疗效的指标之一

该试验的原则是选用适当的靶细胞

可用可传代的已建株的人肿瘤细胞如

人肝癌 食管癌 胃癌等细胞

经培养后制成单个细胞悬液

按一定比例与受检的淋巴细胞混合

共温一定时间

观察肿瘤细胞被杀伤情况

常用方法有

形态学检查法

将淋巴细胞与肿瘤细胞混合共育后

以瑞氏染液着色

用显微镜计数残留的肿瘤细胞数

计数淋巴细胞抑制肿瘤细胞生长的抑制率

同位素法

以细胞毒指数或51Cr释放率

表示T细胞的细胞毒活性

体内试验特主要有

特异性抗原皮肤试验

常见的是结核菌素皮肤试验

依据皮肤反应的结果来判断

反应越强

皮肤的硬结越大越红越有水疱

即呈阳性

皮试呈阳性只能说明有结核感染

发生结核病的概率在10%左右

所以结核菌素皮肤试验呈阳性

需要进一步检查胸部X射线片

痰等判断有没有结核

PHA皮肤试验

定量PHA注射到受试者前臂的皮肤内

可非特异性刺激T细胞发生母细胞转化

呈现单个核细胞浸润为主的炎症

24-48达高峰 >15cm为阳性

方法学评价为敏感性高

安全可靠

临床常用于检测细胞免疫水平

B细胞检测功能

主要有溶血空斑试验

如图片所示

一个溶血空斑表示

一个抗体形成细胞溶血空斑的大小

表示抗体形成的量和酶联免疫斑点试验

主要测定

药物或手术对体液免疫功能的影响和评价

免疫治疗或免疫重建后机体体液免疫状态

那NK细胞活性测定又可以哪些方法呢

正常情况下

LDH不能透过细胞膜

当靶细胞受到效应细胞攻击而损伤时

细胞膜通透性改变

LDH从胞质中释放出来

从而检测LDH的量反应NK细胞的活性

常用的方法有

形态学法

酶释放法和放射性核素释放法

最后我们来学习其他免疫细胞功能检测技术

前面已经学习了淋巴细胞的检测

接下来我们来学习吞噬细胞的功能检测

吞噬细胞是指具有吞噬功能的一类细胞

比如中性粒细胞

巨噬细胞和单核细胞等

吞噬细胞的吞噬运动大致可以分为趋化

吞噬和胞内杀伤作用三个阶段

首先我们来学习中性粒细胞功能检测

主要检测为中性粒细胞

中性粒细胞有什么作用呢

主要作用有在坑化脓性细菌感染中

起重要防御作用

引起感染部位急性炎症反应

参与超敏反应

引起机体免疫病理损伤

中性粒细胞功能检测包括

趋化功能检测

吞噬和杀菌功能检测

如图所示

趋化功能检测的原理是

中性粒细胞趋化因子在微生物细胞成分

及其代谢产物补体活性片段C5a

C3a等作用下产生趋化运动

如图所示吞噬和杀菌功能测定是

中性粒细胞具有吞噬杀菌功能

当与颗粒性物质

混合孵育一定时间后

颗粒性物质被吞噬杀灭

根据吞噬率

吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能

可以分为显微镜检查法

溶菌法和NBT还原试验

显微镜检查法

检测原理是将受检细胞悬液按一定比例混和

继加活的白色念珠菌悬液

保温加美蓝溶液作活体染色

取样涂片镜检

如果胞内白色念珠菌呈蓝色

表示该菌已被杀死

一共计100或200个细胞

分别计算吞噬率和杀菌率

溶菌法是将

白细胞悬液+新鲜人血清

调理过的细菌按照一定比例混合

温育计数生长菌落数

NBT还原试验是细菌感染时

正常的中性粒细胞能量消耗剧增

耗氧量增加

糖代谢活跃

有氧化还原反应

糖氧化过程中所脱的氢可被吞噬

或渗透到中性粒细胞胞质内的NBT染料接受

使淡黄色的NBT还原成蓝黑色的甲臢

以折光性强的点状

或斑块状颗粒沉积于细胞内

镜下检查NBT阳性细胞数量

便可推知中性粒细胞的杀菌功能

最后我们来学习巨噬细胞功能检测

巨噬细胞待检标本很难获得

必要时采用斑蝥敷贴法收集

该法对人体有一定损伤

试验方法可参考中性粒细胞检测

本节内容学习到这里 谢谢大家