免疫电镜技术在线视频

大家好

我们继续来学习第五节免疫电镜技术

免疫电镜技术

指的是是利用高电子密度的颗粒性标记物

如胶体金 铁蛋白等标记抗体

或用经免疫组织细胞化学反应

能产生高电子密度产物者如HRP标记抗体

在电子显微镜下

对抗原抗体反应中的

高电子密度标记的抗原

进行亚细胞水平定位的技术

那免疫电镜技术具有那些优点呢

相较于其他免疫组织化学技术是

在光镜下进行抗原定位

免疫标记电镜技术

在电子显微镜下的定位更为精确

可定位至细胞膜 细胞器

在探索病因 发病机制

组织发生等方面有其独特的优点

具有独特优点的同时

免疫标记电镜技术对标本制备

也有相当高的要求

在组织固定与取材时为保持组织的抗原性

固定剂不宜过强

在取材方面

免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求

更迅速 更精细

在免疫染色方面

又分为包埋前染色

包埋后染色和超薄切片染色三种

三种染色各有优缺点

其中包埋前染色优点是

切片染色前不经过锇酸固定

脱水及树脂包埋等过程

抗原未被破坏

易于获得良好的免疫反应

特别适合用于含抗原量较少的组织

包埋后染色优点是超微结构保存较好

方法简便

阳性结构有高度的可重复性

能在同一张片上切出多重的染色效果

但抗原效果可能减弱

甚至丧失或者抗原性质发生改变

超薄切片免疫染色　

是将组织置于2.3mol/L蔗糖液中

以液氮速冻 冷冻切片

由于不需经固定 脱水

包埋等步骤

直接进行免疫染色

所以抗原性保存较好

兼有包埋前和包埋后染色的优点

同时大家通过之前课程的学习也知道

特异性高 亲和力强的高效价抗体

是获得理想的免疫标记结果的首要条件

大分子完全抗原可直接免疫动物

如家兔 山羊 豚鼠

小鼠来获得抗体

半抗原用偶联剂使

半抗原与大分子物质结合成复合物

再去免疫动物产生抗体

大分子物质称为载体蛋白

以甲状腺球蛋白

牛血清白蛋白或血蓝蛋白最为常用

偶联剂为戊二醛或碳二酰亚胺等

目前细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体最为理想

大家要熟悉

常用的免疫标记电镜技术哪三种

第一种为免疫胶体金染色法

指的是以胶体金作为示踪标志物

胶体金标记免疫电镜技术

是目前应用最广泛的免疫电镜标记物

这个技术是将胶体金作为抗体的标记物

用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位

胶体金主要具有以下几个优点

首先胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白

而且蛋白的生物活性不发生明显改变

可制备抗体-胶体金

蛋白A-胶体金

卵白素-胶体金

植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜

其次在电镜下金颗粒电子密度高

圆形且界线清晰

易于辨认定位比酶反应物更精确

最后胶体金标记物易于制备

并可以根据需要制备不同大小的胶体金

因此可进行免疫电镜的双重或多重标记

胶体金颗粒能发射强烈的二次电子

是扫描电镜的理想标记物

胶体金经过银显影增强后

金颗粒外周吸附大量银颗粒

而呈现黑色或黑褐色

因此也能用于光学显微镜观察

此外胶体金还能用于

冷冻蚀刻标本的免疫标记

第二种是免疫胶体铁细胞化学染色法

胶体铁是一种阳离子胶体

将抗体分子标记上胶体铁

通过普鲁士蓝反应呈色

可用在电镜和光镜水平上的

抗原定位研究

铁蛋白标记技术适用于

细胞膜表面抗原的定位

由于其分子量较大

不易穿透细胞膜

定位细胞内抗原较为困难

铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强

不适用于包埋后免疫标记

使用受到一定限制

第三种是酶免疫电镜技术

指是利用酶的高效率催化作用

对其底物的反应形成不同的电子密度

借助于电子显微镜

通过对酶的定位

对抗原抗体进行定位 

好 大家今天这节课程学习到这里

好 谢谢大家