酶免疫试验（上）在线视频

大家好我们今天开始讲酶免疫试验

酶免疫试验

是建立于20世纪70年代

是继荧光免疫和放射免疫试验之后的

三大经典免疫标记技术之一

是一种以酶标记抗体或者抗原

作为主要试剂

将酶高效催化反应的专一性

和抗原-抗体反应的特异性

相结合的免疫检测技术

它的技术特点

具有灵敏度高特异性强

试剂性质稳定操作简便快速

无放射性污染应用范围广等优点

那酶免疫试验的组成要素有哪些呢

酶免疫试验的基本组成要素

为酶结合物和酶作用底物

而将抗原或抗体结合到固相载体表面

是异相酶免疫试验主要的分离方式

那么下面我们首先看看固相载体有什么要求

我们可以选择哪些种类呢

首先固相载体要求

第一个结合抗体或抗原的容量大

第二个可与大分子蛋白质

牢固地结合在其表面

且可长期保存

第三反应充分不影响活性

第四个简便易行快速经济

那么固相载体的种类有哪些

怎么样选择呢

首先我们看一下微孔板

微孔板目前国内外

一般均使用聚苯乙烯材料

因为这种材料具有很好的光透性

和蛋白吸附能力且

很容易加工成微孔板

试管 微珠微球

它的价格非常低廉

磁微粒

由高分子单体

磁微粒聚合成的微球或颗粒

直径为um

也称为顺磁性微粒

它一般分为三层

核心是金属颗粒

中间层为均匀包裹的聚苯乙烯

最外层为含有结合基团

如氨基羧基羟基等等

它们这个功能基团

可与抗体或抗原偶联

结合容量特别的大

反应特别的快

分离步骤简单迅速

容易自动化

膜载体包括硝酸纤维素膜

俗称NC膜

聚偏二氟乙烯膜

俗称PVDF膜

玻璃纤维膜及尼龙膜等微孔滤膜

通过非共价键吸附抗体和抗原

吸附能力强

NC膜广泛用于斑点酶免疫吸附试验

和免疫印迹试验的固相载体

PVDF膜主要用于酶联免疫斑点试验检测中

可使呈色斑点集中

清晰对比度高

大大提高了斑点试验的灵敏度

包被抗原或抗体

将抗原或抗体结合在固相载体上的过程

那么它分为直接包被

将抗原或抗体直接吸附于固相载体表面

常用牛血清白蛋白或小牛血清进行封闭

消除非特异性的干扰

那么间接包被

采用亲和素-生物素化抗体抗原模式

或葡萄球菌蛋白A抗体模式

将抗体或抗原间接吸附于固相上

减少空间位阻效应 

酶结合物

是指通过化学反应将酶

与抗体或抗原形成结合物

也称酶标记物

既参与高度特异的免疫反应

又起到生物催化放大作用

最终通过酶与显色底物或

发光底物的相互作用来指示

辣根过氧化酶碱性磷酸酶

β-半乳糖苷酶

酶的显色底物与酶促发光底物

辣根过氧化酶的底物是四甲基联苯胺

是ELISA最常用的显示底物

作用后显蓝色

对比非常的清晰

其它还有邻苯二胺

酶促发光底物主要标记酶

由辣根过氧化酶和碱性磷酸酶

可催化相应底物发光

HRP的常用发光底物

为鲁米诺及衍生物对羟基苯乙酸

ALP常用的发光底物则是

AMPPD和4-甲基伞形酮磷酸盐

酶免疫试验的分类

按照实际应用分为酶免疫测定技术

和酶免疫组织化学技术

酶免疫组织化学技术主要针对

组织切片或其它标本中抗原的定位

这样两大类

前者根据抗原-抗体反应后

进行酶活性检测时候

是否需要将游离的和结合的酶标记物分离

可分为均相和异相

异相又称非均相

酶免疫试验两种类型

异相酶免疫试验又分为

液相酶免疫试验和固相酶免疫试验

均相酶免疫试验的原理

酶标记物与相应抗原抗体发生反应后

标记酶的活性会发生改变

通过检测酶活性的改变

即可测定待测物的含量

检测时不需分离结合标记物和游离标记物

酶放大免疫试验技术

酶标记小分子半抗原后

酶活性及半抗原的活性均不受影响

而当酶标半抗原与特异性抗体结合后

由于半抗原分子量小

因而抗体与半抗原的结合

就使得抗体与标记酶密切接触

导致酶的活性中心受到影响

进而使酶活性受到抑制

检测时酶标半抗原和待测半抗原

竞争性与特异性抗体结合

如果标本中含待测抗原

与酶标抗原竞争结合抗体

酶标抗原量一定

酶催化底物显色

如标本中没有待测抗原

则酶标抗原出现位阻现象

克隆酶供体免疫试验

β-半乳糖苷酶是由

4个相同亚基组成的四聚体

利用基因重组技术分别表达β-半乳糖苷酶

利用β-半乳糖苷酶小片段

酶受体标记抗原

与特异性抗体竞争性结合

如ED标记抗原与抗体结合

不能与大片段结合

反应平衡后

游离ED标记抗原与EA结合

形成具有活性的酶

加入底物测定酶活性

酶活性的强弱

与标本中抗原含量呈正相关

异相酶免疫试验

是将抗原抗体吸附在固相载体上

是免疫反应在固相载体表面上进行

待测物质酶标记抗体或抗原

存在于液相

弃去液相并洗涤

加入底物

通过测定固相载体上的酶标记物

催化底物的显色程度或发光强度

确定标本中的抗原或抗体的量

酶联免疫吸附试验的原理是

酶免疫测定技术中应用最广的技术

将已知的抗原或抗体吸附在固相载体

比如说聚苯乙烯微量反应板

一般为96孔板

这个图可以看见

使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行

用洗涤法将液相中的游离成分洗除

前者用于检测大分子抗原

后者用于测定特异抗体 

步骤如图所示

第一步包被抗体或抗原

第二步将待测标本

含待测抗原或抗体

和酶标记的抗体或抗原按照一定程序

加入反应体系中

与结合在固相载体上的抗原或抗体反应

形成固相化的抗原-抗体-酶复合物

第三步以洗涤的方法将固相抗原抗体-酶结合物

与其它成分分离

结合在固相载体上的酶量

与标本中待测物质的量呈一定比例

第四步显色

加入酶反应底物后

底物被固相载体上的酶催化生成有色产物

产物的量与标本中待测物质的量直接相关

故可以根据呈色的深浅进行定性或定量分析

常用的方法 有夹心法双抗体夹心法

它的原理是

包被于固相载体上的抗体

和液相中的酶标抗体

分别与检测标本中的待测抗原分子上

两个不同抗原表位结合

最后形成固相抗体待测抗原酶标抗体复合物

洗涤去除游离的酶标抗体和其它成分

加入底物

酶催化底物由无色变为有色产物

加终止液

根据底物显色的深浅

确定标本中的待测抗原的含量

步骤如图所示

首先包被抗体1

洗涤

再加待标本加酶标特异性抗体

再加底物显色

那么双抗原夹心法

原理和上面一样

只是把抗体换成抗原即可

那么间接法呢

间接法是指

检测抗体最常用的方法

其原理是标本中待测抗体与固相抗原反应

形成固相抗原待测抗体复合物

加入酶标二抗

形成固相抗原待测抗体酶标二抗复合物

酶标二抗一般是抗人IgG

是针对免疫球蛋白分子同种型抗原表位

能与该种属所有个体免疫球蛋白分子

比如说人IgG结合

而与待检抗体的特异性无关

因此 该法只需更换固相包被抗原

就可用一种酶标二抗检测标本中

多种针对不同抗原的抗体

具有很好的通用性

机体血液中IgG类抗体浓度比较高

其中绝大部分为机体接触外界环境

刺激所产生的非特异性IgG

因此

为避免非特异性IgG

对固相吸附所致的假阳性反应

通常会将待测标本做一定程度的稀释

那么竞争法

竞争法的原理是

标本中待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合

标本中待测抗原含量越多

与固相抗体的结合越多

酶标抗原与固相抗体结合的越少

加入底物酶催化底物显色

根据测定溶液吸光度

确定待检抗原含量

它的方法是

用已知抗体包被

加入待测血清

再加酶标抗原

酶标抗原与待检物竞争与包被物结合

加底物显色

应用主要用于检测

只有一个抗原决定簇的小分子半抗原

比如说药物激素等等

捕获法

是将抗人IgMμ链抗体包被在固相上

捕获待测标本中所有的IgM类抗体

包括特异性和非特异性的抗体

洗涤除去未接合的其它成分

加入特异性抗原

和酶标记针对特异性抗原的抗体 

形成固相抗人μ链抗体

IgM抗原酶标抗体这样复合物

加入底物显色

底物显色的深浅与标本中

待测抗体的含量成正比

本节小结

本节讲授了酶免疫试验的组成要素

均相酶及异相酶免疫试验的原理及方法

还有分类

着重讲了酶联免疫吸附实验的原理方法及应用

下一节我们继续