7.4 蛋白相互作用的研究方法在线视频

大家好

我是来自中南大学生命科学学院的何海伦

今天给大家介绍的课程的内容

是蛋白质相互作用的研究方法

我们都知道蛋白质的相互作用

在生物体内是十分重要的

什么是蛋白质相互作用呢

就是指两个或两个以上的蛋白分子

通过非共价形式联接成蛋白质复合体的过程

我们就把它叫做蛋白质的相互作用

研究蛋白质相互作用的方法很多

主要包括像酵母双杂交 免疫共沉淀

GST Pull-Down分析

还有表面等离子共振 等温滴定为量热

荧光共振能量转移

以及共定位荧光染色技术等一些方法

首先我们来介绍一下酵母双杂交

酵母双杂交系统是89年发展起来的一个技术

目前为止已经有6万多次的引用率

它主要是基于酵母双杂交系统里边

酵母里边一个GAL酶

这个GAL蛋白可以特异性的

它有两个区域

一个是氮端的这种BD结合区

它可以和DNA序列相互结合

然后还有一个碳端的AD区

这个AD区就可以启动下游的基因的表达

如果想使蛋白行使功能启动下游表达

必须BD区和AD区相互靠近

才能久活性

就是通过这个特点

我们把它的AD区和BD区

分别于我们要待测的这种蛋白进行共表达

比如用BD与X蛋白融合

而AD区与Y蛋白进行融合

如果X和Y这两个蛋白之间

可以进行相互作用的话

它就可以形成蛋白-蛋白的复合物

这样使BD区和AD区相互靠近

就能启动下游基因的表达

这就是酵母双杂交的一个原理

通过这个方法我们可以发现

已知蛋白相互作用蛋白

还可以鉴定两个蛋白之间是否存在相互作用

还可以确定蛋白相互作用的一个具体的区域

酵母双杂交的优点十分明显

比如灵敏度比较高 很简洁 很方便

应用也非常广泛 易于转化

但缺点也同样的非常显著

首先它的转化效率是比较低的

再有酵母双杂交系统还具有这种假阳性的特点

为什么呢

就是如果你要是检测这个蛋白

本身具有下游的转录激活活性

它就可能出现这种假阳性

检测蛋白质相互作用的第二种方法是

免疫共沉淀

也就我们从说的这种CO-IP技术

也被称为免疫共吸附或免疫下拉技术

它是以抗原 抗体之间专一性作用为基础的

用于研究蛋白质相互作用的一个经典方法

我们来可以看一下下边这个流程

当我们把细胞进行破壁

获取它的全蛋白以后

我们把一个蛋白的抗体固定在磁珠上

然后这个抗体就会和目的蛋白进行结合

如果我们这些蛋白混合物里有

和目的蛋白相互作用的这些蛋白

就会一块结合到我们的抗体上

就是带磁珠的抗体上

然后我们通过洗脱把蛋白复合体洗脱下来

把蛋白复合体洗脱下来

再通过SDS电泳把它分别的分开

再去做质谱鉴定

从而得知和这个目的蛋白相互作用的

其它蛋白都有哪一些

免疫共沉淀最大的特点是

我们可以通过相互作用蛋白质

都是经过翻译后修饰

所以它是一个处于天然状态下的蛋白质

也就说是我们细胞体内一个自然状态下蛋白质

这个相互作用也是在自然状态下进行的

不会有人为的这些影响

缺点是灵敏度一般

如果这两个蛋白相互作用力非常低

或者这种瞬间作用蛋白质

我们可能就没法通过这种方式来检测到

还有两种蛋白质结合

可能不是直接结合

需要第三个蛋白在它们当中进行介导

那这样的话我们也不能进行一个准确的检测

还有如果下游我们想用western blot进行检测

那必须在实验之前

我们就要知道这个蛋白是什么

制备它相应的抗体

这一点也是比较麻烦的

检测蛋白质相互作用的第三个方法

就是GST Pull-Down技术

那这个技术就是基于一个共表达

我们要把我们的靶蛋白和GST

也就是谷胱苷肽巯基转移酶

把它共融合表达得到的这个融合蛋白

因为它有GST可以固定化在

谷胱苷肽亲和的树脂上

作为一个固定支持介质

就是像这个样子固定在固定支持介质上

当我们要检测的蛋白流经这个树脂的时候

那与靶蛋白相互作用的其它蛋白

就会挂在这个蛋白上

也挂在这个固相支持物上

然后我们再通过谷胱苷肽进行洗脱

把这个整个的蛋白复合体都洗脱下来

然后进一步通过电泳的方式

或者质谱的方式来进行检测

与我们的靶蛋白

也就目的蛋白相互作用

这些蛋白质到底是什么

Pull-Down技术最大的优点就是方便易行

操作简单

而且非常敏感

对所有的蛋白都一视同仁

缺点也同样非常的显著

首先因为它是和GST

也就是谷胱苷肽转移酶共表达的

而谷胱苷肽转移酶

它本身就有两万多的分子量

所以它可能有可能对你下游的

靶蛋白的空间结构造成一定的影响

再有这个蛋白质的浓度

对实验也会有比较明显的影响

就是你的表达量要有

第四种蛋白检测相互作用的方法

就是等温滴定微量热

也就我们常说的ITC

它是需要用到等温滴定微量热仪的

适用于量化研究各种分子相互作用的一种技术

可以直接测量生物分子在相互作用过程中

它的吸热或者放出的能量

来通过这种热量的变化

来推断这个蛋白之间相互的作用

看这就是等温滴定微量热仪的一个外观

当我们把一种蛋白滴加到

另一种蛋白溶液当中的时候

它两个如果发生相互作用

就会在相互结合的过程中

产生吸热和放热反应

出现一系列峰

通过这个峰向变化

我们可以拟和计算它的之间的亲和力

以及焓和熵的变化

第五种的蛋白质相互作用方法

就是表面等离子共振

也叫SPR

是先将靶分子键合在生物传感器的表面

我们一般叫做芯片

会有四个通道

再将含有另一种能与靶分子产生相互作用的

这种蛋白溶液流经在这个芯片的表面

也就是说生物传感器的表面

如果这个蛋白能够和我们的已经结合的

生物传感器表面的蛋白相互作用的时候

它就会造成生物芯片表面质量的增加

就有两种蛋白叠加在上面

那当光打过来的时候

它的折射指数就肯定会发生变化

因为蛋白的量增加了

那从而显示出它是分子间的相互作用

就会被检测到

这就是出来的谱线是这个样子的

这边就是它的结合曲线

这边就是它的解离曲线

我们可以根据这些曲线的变化

来测定它的结合和解离常数

这张图就是我通过用SPR

也就是表面等离子共振这种技术

来研究蛋白酶的PPC结构域和底物蛋白

藻蓝蛋白之间的吸附和解离的

一个动态的过程

它们之间蛋白是怎么相互进行作用的

第六种蛋白相互作用的方法

叫做荧光共振能量转移

是指当很近的两个荧光分子

它之间会产生一种能量转移的现象

我们可以来看这个模式图就更好理解

我们先把第一种荧光分子

比如说它会发蓝色荧光的荧光分子

和一个蛋白分子进行共表达

然后还有一个发绿色荧光的荧光分子

和另一个蛋白分子进行共表达

当这底下这两个蛋白分子不相互作用的时候

那我们再通过检测的时候

就会发出蓝光

因为只有第一个入射光

来激发第一个荧光分子

但是如果当两个蛋白

待检测蛋白相互作用的时候

那它们之间的荧光分子就会靠得非常近

再用紫外光照射第一个荧光分子

发蓝光这个荧光分子

它的发射光

就会作为第二个荧光分子的激发光存在

然后激发第二个荧光分子

这时候放出的就不是蓝色光

而是绿色光了

那我们就可以通过这种荧光颜色的变化

来检测我们两个蛋白是否发生了相互作用

如果两个蛋白相互靠近小于10nm的时候

我们就认为这两个蛋白是发生相互作用了

从而造成两个荧光分子

它出现了这种能量的转移现象

当然这种荧光共振转移

我们可以来做生物学或医学当中的

非常多的实验研究

像分子内蛋白的相互作用

还有膜蛋白受体间的相互作用

以及细胞凋亡的研究

都可以利用到该项技术

下面我们来介绍一下荧光共振能量转移

这个方法的优点和缺点

优点非常的明显

比如这个方法它是在活细胞的正常生理条件下

就可以进行检测的

所以在我们观察大分子在细胞内的构象变化

与相互作用的时候就特别的方便

而且弥补了破碎细胞过程中相互检测蛋白作用

会对蛋白造成的一些影响

而且灵敏度非常高

因为它是有荧光的

所以它的检测线是比较低的

可以实现对单细胞水平的研究

而且研究单个受体分子

而且还可以与多种仪器进行联合使用

像各种显微镜 色谱技术

以及流式细胞技术等等

缺点也非常的明显

就是它有很强的应用局限性

因为在这个过程中

你需要对蛋白进行荧光标记

你要选择合适的这种荧光物质才能去偶联

再有对实验的技术要求比较高

你首先这两个荧光分子受体的光谱要重叠好

不然的话就会导致荧光互相干扰

因此要不断地探索这种合适的供体和受体

才能够进行合理的标记分子

同时对于这种瞬时间相互作用的

蛋白间的相互作用

它也是很难检测到的

比如这就是用荧光能量共振转移的

一个具体的案例

它是通过用荧光标记了钙调素

以及它相应的联接蛋白

然后来进行它之间相互作用的一个检测

你看如果这两个蛋白如果不相互作用的话

它是应该发绿色荧光的

随着钙离子浓度提高

两个蛋白就开始进行相互作用

你看两个蛋白就相互靠近

这样第一个绿色荧光的发射峰

就可以激发到第二个黄色荧光蛋白

让它激发从而使它发出黄色荧光

这时候我们在荧光显微镜下

看到的就是黄色荧光的发出

通过这种发荧光的改变

我们发现了这两个蛋白之间

确实随着钙离子浓度提高存在着相互作用

最后一种给大家介绍的

这种蛋白质相互作用的方法

就是共定位的荧光染色技术

平常这种方法我们很少用来

检测蛋白质相互作用

但是也是可以的

平常我们只是用这种方法

来检测这种蛋白到底在我们细胞里边

哪个位置定位

我们可以用这种方法来检测蛋白相互作用

是基于我们这些蛋白的一个共表达的

比如我们把荧光蛋白

还有我们要检测蛋白以及这种定位因子

共同融合表达在一起

像这个就是要定位在细胞质当中的

一个定位因子

然后这个是定位在细胞核的一个定位因子

如果要是本来它们之间如果不相互作用的话

这个就会在细胞质中我们检测到绿色荧光

然后在细胞核里边检测到红色荧光

但是如果蛋白A和蛋白B

它俩之间存在这种蛋白相互作用

那我们就会在蛋白B的拽动下

我们蛋白A的整个表达体

就是进入到了我们细胞核中

所以我们会在细胞核中检测到绿色荧光

和红色荧光的这么一个夹层现象

从而显示这两个蛋白是否有相互作用

以上就是给大家介绍的

各种蛋白质的相互作用的

一些技术的研究方法

大家可以根据自己的实验内容

来进行挑选合适自己研究的一些实验方法

来阐明你所做的蛋白和别的蛋白之间

是否存在这种相互作用

好了 这节课我们就上到这

谢谢大家