当前课程知识点:医学科研设计 > 第八章 细胞生物学研究基本策略 > 8.8抗肿瘤研究的基本策略-2 > 8.8 抗肿瘤研究的基本策略-2
大家好
我是中南大学湘雅药学院程岩
今天我为大家讲的内容是
抗肿瘤研究的基本策略第二部分
下面我们介绍一下细胞凋亡
细胞凋亡也被称为I型程序性细胞死亡
是细胞死亡的主要途径
细胞凋亡是细胞的一种基本的生物学现象
指为维持内环境稳定
由基因控制的细胞自主的有序的死亡
细胞凋亡是主动过程
它涉及一系列基因的激活表达以及调控等作用
下面这张图描述了细胞凋亡发生时
细胞发生的一些形态学特征
发生凋亡时细胞体积会缩小
核质浓缩
整个细胞通过发芽起泡的方式形成一些突起
这些突起会脱落形成大小不等的膜包小体
这些膜包小体就被称为凋亡小体
凋亡小体会被吞噬细胞所吞噬
凋亡小体里面包含着胞浆细胞器以及一些核碎片
大部分抗肿瘤药都是通过诱导肿瘤细胞凋亡
导致肿瘤细胞死亡发挥抗肿瘤作用的
下面我们介绍一下细胞凋亡的
一些基本的检测方法
第一个是根据凋亡形态学特征的检测方法
我们可以通过光学显微镜观察凋亡小体
如图所示第一张图
是正常情况下细胞的形态学特征
那么这个细胞正常情况下
它是呈这种长梭形的
那么当加药处理以后
我们可以看到细胞的形态学
发生了明显的变化
那么大部分细胞皱缩变圆体积变小
那么部分细胞表面形成了很多的突起
那么我们也可以观察到这些脱落的凋亡小体
另外我们也可以通过荧光显微镜
观察细胞核染色质的形态学改变
常用的DNA的特异性染料
包括Hoechst的和DAPI
那我们可以看一下这个结果
那么与对照细胞相比那么加药处理以后
我们可以看到细胞当中
有非常明显的这种荧光的颗粒
那么这个就是由于细胞核裂解为碎块
荧光聚集形成这种点状的分布
第二种方法
是通过Annexin V/PI流式细胞术来分析细胞凋亡
在细胞凋亡的早期
磷脂酰丝氨酸可以从细胞膜的内侧
翻转到细胞膜的表面
暴露在细胞的外环境当中
Annexin V能够与磷脂酰丝氨酸有高度的亲和力
用荧光素标记的Annexin V可以通过流式细胞术
来定量的分析细胞凋亡
因此Annexin V被称为
检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一
碘化丙啶PI是一种核酸染料
它不能透过完整的细胞膜
但在凋亡中晚期的细胞以及死细胞当中
PI就能够透过细胞膜而使细胞核红染
因此我们将Annexin V与PI匹配使用
就可以将凋亡早晚期的细胞
以及死细胞区分开来
我们看一下凋亡的结果
如图所示Annexin V/PI
流式细胞术分析可以把细胞划分为四个象限
左下角的第一象限
代表的是Annexin V和PI都是阴性的细胞
表示正常细胞的比率
右下角的第二象限
代表的是Annexin V阳性 PI阴性的细胞
代表的是凋亡早期的细胞
右上角的第三象限代表的是
Annexin V和PI都是阳性的细胞
表示的凋亡晚期的细胞
左上角的第四象限
代表的是Annexin V阴性PI阳性的细胞
表示的是死细胞的细胞的百分率
那么如图所示我们可以看到与对照细胞相比
那么加药处理以后随着化合物浓度的增加
凋亡的早期和晚期的细胞的比例明显的增多
线粒体膜电位的检测
线粒体在细胞凋亡的过程当中起着枢纽的作用
在受到凋亡诱导以后
线粒体跨膜电位会发生改变
导致线粒体膜通透性的变化
线粒体膜通透性变化以后
线粒体当中的蛋白就会释放到胞浆当中
例如细胞色素c
细胞色素c从线粒体
释放到胞浆当中以后
会与caspase9形成复合物激活caspase9
那么进一步激活下游的caspase诱导细胞凋亡的发生
线粒体跨膜电位的下降
被认为是细胞凋亡级联反应过程当中
最早发生的事件
常用的检测线粒体膜电位的荧光染料
包括Rhodamine 123和JC-1
在线粒体跨膜电位去极化发生改变的时候
JC-1会从红色荧光变成绿色荧光
因此我们可以通过检测绿色和红色荧光
来定性和定量的检测线粒体膜电位的变化
如图所示与对照细胞相比
那么加药处理以后
可以看到随着药物浓度的增加
JC-1绿色荧光的比率明显的增多
说明药物导致了线粒体膜电位的变化
Caspase家族蛋白的检测
Caspase为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶
是一组存在于胞浆当中具有类似结构的蛋白酶
Caspase家族蛋白与真核细胞凋亡密切相关
并参与细胞的生长分化等
Caspase家族引起的级联反应
是细胞凋亡过程的中心环节
其中Caspase3被认为是凋亡的关键执行分子
一旦被激活即发生下游的级联反应
使凋亡不可避免
在正常情况下
胞浆中的Caspase以无活性的酶原形式存在
当被剪切以后成为活性形式
活化的Caspase能够进一步切割其底物
PARP DNA修复酶就是Caspase的底物
那么因此我们可以通过Western Blot的方法来检测
Caspase和PARP的剪切形式
来证明细胞凋亡的发生
除了检测Caspase家族蛋白的变化
我们也可以通过检测BCL-2家族蛋白的变化
来证明细胞凋亡的发生
BCL-2基因即B细胞淋巴瘤
白血病2基因是一种癌基因
它具有抑制凋亡的作用
目前已经发现的BCL-2蛋白家族
按功能可以分为两类
一类是像BCL-2一样具有抑制凋亡作用的
如BCL-xl BCL-W MCL-1等等
而另一类是具有促进凋亡作用的
如bax bak bik bid的等等
那么如图所示我们可以看到
随着化合物浓度的增加
BCL-2抗凋亡蛋白包括MCL-1 BCL-XL BCL-2
它们的蛋白表达明显的下降
那么我们也可以观察到
随着化合物浓度的增加
BCL-2家族的促凋亡蛋白
包括bad和bax它们的蛋白表达明显的增多
那么我们就可以通过检测BCL-2家族蛋白的变化
来证明化合物诱导细胞凋亡的发生机制
谢谢大家
抗肿瘤研究的基本策略
第二部分到此结束
-1.1医学科研的基本程序
--1.1医学科研的基本程序 习题
-1.2实验动物基本知识
--1.2 实验动物基本知识 习题
-1.3科研道德与诚信教育
--1.3 科研道德与诚信教育 习题
-1.4人体实验的伦理原则
--1.4 人体实验的伦理原则 习题
-1.5动物实验的伦理学原则
--1.5 动物实验的伦理学原则 习题
-1.6医学科研项目的选题
--1.6 医学科研项目的选题 习题
-2.1假说的作用与特点
--2.1 假说的作用与特点 习题
-2.2形成假说的思维方式
--2.2形成假说的思维方式 习题
-3.1医学科研的基本要素-被试因素
--3.1医学科研的基本要素-被试因素 习题
-3.2医学科研的基本要素-研究对象
--3.2 医学科研的基本要素-研究对象 习题
-3.3医学科研的基本要素-实验效应
--3.3 医学科研的基本要素-实验效应 习题
-4.1医学科研统计学设计的目的与基本策略
--4.1 医学科研统计学设计的目的与基本策略 习题
-4.2对照原则-对照的意义与形式
--第四章 医学科研设计的统计学原则--4.2 测试
-4.3对照原则-对照的设置与常见错误
--4.3 对照原则—对照的设置与常见错误 习题
-4.4随机、重复、均衡及盲法原则概述
--4.4 随机、重复、均衡及盲法原则概述 习题
-4.5随机原则
--4.5 随机原则
--4.5 随机原则 习题
-4.6重复原则
--4.6 重复原则
--4.6 重复原则 习题
-4.7均衡原则
--4.7 均衡原则
--4.7 均衡原则 习题
-4.8盲法原则
--4.8 盲法原则
--4.8 盲法原则 习题
-4.9科研数据中离群值的识别与处理
--4.9 科研数据中离群值的识别与处理 习题
-4.10科研过程中对P值的正确理解
--4.10 科研过程中对P值的正确理解 习题
-4.11常见的随机化设计
--4.11 常见的随机化设计 习题
-4.12配对、配伍和交叉设计
--4.12 配对、配伍和交叉设计 习题
-5.1实验误差及控制
--5.1 实验误差及控制 习题
-5.2有效数及其处理
--5.2 有效数及其处理 习题
-6.1医学形态学研究的基本思路概述
--6.1 医学形态学研究的基本思路概述 习题
-6.2常用生物组织的固定剂
--6.2 常用生物组织的固定剂 习题
-6.3免疫组织化学染色结果评价与非特异染色的控制
--6.3 免疫组织化学染色结果评价与非特异染色的控制 习题
-7.1基因文库及其应用
--7.1 基因文库及其应用 习题
-7.2组学的研究意义
--7.2 组学的研究意义 习题
-7.3蛋白功能研究的基本策略
--7.3 蛋白功能研究的基本策略 习题
-7.4蛋白相互作用的研究方法
--7.4 蛋白相互作用的研究方法 习题
-7.5基因转录调控研究的基本策略
--7.5 基因转录调控研究的基本策略 习题
-7.6分子生物学实验微量操作技巧
--7.6 分子生物学实验微量操作技巧 习题
-8.1细胞增殖的研究方法
--8.1 细胞增殖的研究方法 习题
-8.2细胞凋亡的研究方法
--8.2 细胞凋亡的研究方法 习题
-8.3免疫应答简介
--8.3 免疫应答简介 习题
-8.4免疫细胞分离技术
--8.4 免疫细胞分离技术 习题
-8.5免疫细胞功能检测技术
--8.5 免疫细胞功能检测技术 习题
-8.6细胞因子检测技术
--8.6 细胞因子检测技术 习题
-8.7抗肿瘤研究的基本策略-1
--8.7 抗肿瘤研究的基本策略-1 习题
-8.8抗肿瘤研究的基本策略-2
--8.8 抗肿瘤研究的基本策略-2 习题
-8.9抗肿瘤研究的基本策略-3
--8.9 抗肿瘤研究的基本策略-3 习题
-8.10抗肿瘤研究的基本策略-4
--8.10 抗肿瘤研究的基本策略-4 习题
-9.1动物实验的一般原则
--9.1 动物实验的一般原则 习题
-9.2动物行为学观察研究的一般原则
--9.2 动物行为学观察研究的一般原则 习题
-9.3实验动物学习记忆观察
--9.3 实验动物学习记忆观察 习题
-10.1功能型研究的基本思路概述
--10.1 功能型研究的基本思路概述 习题
-10.2 在体实验与体外实验的结合
--10.2 在体实验与体外实验的结合 习题
-10.3 量效关系和时效关系相结合
--10.3 量效关系和时效关系相结合 习题
-10.4 增加和减少验证相结合
--10.4 增加和减少验证相结合 习题
-10.5 配体-受体顺向与逆向研究
--10.5 配体-受体顺向与逆向研究 习题
-10.6 细胞水平功能研究的基本技术路线
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-11.1实验结果的专业判定1——实验结果可靠吗
--11.1 实验结果的专业判定1——实验结果可靠吗 习题
-11.2实验结果的专业判定2——实验结果可靠吗
--11.2 实验结果的专业判定2——实验结果可靠吗 习题
-11.3实验结果的专业判定3——实验结果可靠吗
--11.3 实验结果的专业判定3——实验结果可靠吗 习题
-11.4实验结果的专业分析1——实验结果的解释与结论
--11.4 实验结果的专业分析1——实验结果的解释与结论 习题
-11.5实验结果的专业分析2——实验结果的解释与结论
--11.5 实验结果的专业分析2——实验结果的解释与结论 习题