7.1 基因文库及其应用在线视频

大家好

我是来自中南大学生命科学学院的何海伦

这节课要给大家介绍的是基因文库

及其在医学研究中的应用

我将从以下三个方面给大家进行介绍

首先我们来看一下什么是基因文库

简单来说

将某一生物DNA片段群体

与载体分子进行重组

然后把它转化到宿主细胞中

转化了细胞在选择培养基上

生长出来的单个菌落

这时每个菌落都含有

我们要检测生物的一个DNA片段

形成一个克隆

这样我们把这些

全部的DNA片段克隆集合在一起

那这就是这个生物的基因文库

要想构建基因文库

我们需要有三个要素注意

第一个就是你要有

大小合适的DNA片段

那第二个

就是需要有合适的载体分子

那第三个是要有合适的宿主细胞

首先我们来看

如何获得大小合适的DNA片段

我们通常用两种方法来获得

第一种就是限制性内切酶切割法

我们用合适的限制性内切酶

把我们的整个DNA进行切割

获得大小合适的这种序列片段

再有一种方法

就是机械切割法

就利用超声波将DNA断裂成

大小合适的这种片段

第二个要素就是选择适合的载体

不同的载体

它能承载的这种

DNA片段大小是不一样的

像*的噬菌体

我们一般是适用于装这种20kb

以下的DNA片段

所以在你选择限制性酶切的时候

你可能酶切位点

就相应的要多一些

像这种细菌人工染色体

它就能承载到300KB的

这种DNA片段

那所以你的限制性酶切也好

或者是超声波破碎来断裂也好

那个片段就要求的比较大

第三个要素

就是它的选择宿主细胞

当你的载体构建好了以后

质粒构建好了

你要把它转入你的宿主细胞当中

这个宿主细胞

我们常用的有大肠杆菌

枯草杆菌或者各种酵母菌

那酵母菌一般真核生物

我们就可以用酵母菌

作为它的宿主细胞

一旦我们把这个

克隆构建好了以后

把它转到不同的载体当中

然后再把载体

展示到相应的基础细胞里边以后

下一步我们来做什么

就这个文库构建好了

我们就要把这种克隆的基因

进行分离

在分离的时候

我们肯定要依据一定的原则

可以根据它的载体的特征来进行分离

比如说这个载体本身具有抗性标记的

我们可以来分离

或者通过原位杂交

需要我们这个克隆携载了

我们想要的这种DNA片段

或者是差别杂交

就是基因在细胞特定的这种发育时期

才能表达出来

还有像表达文库通过它的产物

还有一些功能活性检测

来筛选我们的目的基因

那当然我们分离到了

找到了这种克隆

携带了我们所要的这种基因

我们就需要对它进行测序

进行鉴定

就是最后一步那对克隆基因的一个鉴定

通过一些酶切的方法

分子杂交的方法

还有抗性标记的方法来检测

并对它的功能进行分析

这就是常见的基因文库构建的一个流程

并后期的这种下游的工作

那接下来看

我们先看一下

在基因文库里面的第一种基因组文库

所谓基因组文库就是指整套

由基因组DNA片段插入到克隆载体

获得的分子克隆的总和

也是我也就是说我们研究的对象

整个的基因组DNA

它的构建流程

和前面非常相似

就是你获得染色体DNA以后把它片段化

然后把不同的片段连接到

你合适的载体当中

然后把每一个载体

再转入到你的宿主细胞

这样整个的宿主细胞就构成了一个文库

建立和使用基因组文库是分离基因

特别是分离特定真核生物基因的

一个最有效的手段

因为一个像哺乳动物

它的基因组是非常大的

如果直接从这些细胞中提取

或者分离出某一特定基因是比较困难

但是你把它构建在文库当中以后

相应的筛选这些基因就变得比较的简单

所以基因组文库

常用来分离鉴定基因

那右边这张图

我们就是利用了这个构建

酵母菌的

也就白色念珠菌的

它的一个基因组文库

对它的突变体进行了新的分析

发现了28个基因

使得这种光滑念珠菌

对常见的药物产生这种抗药性

就是利用它的构建的文库

来筛选了它的抗基因

第二种文库常见的

我们构建就是CDNA文库

什么叫CDNA文库

就指细胞MRNA

逆转录成cDNA

并克隆的总和

也就是说我们不是针对基因组DNA了

而是针对某种生物

基因组转录的全部mRNA

然后经过反转录

产生的cDNA片段进行的

这种克隆组装形成的这种克隆子的组合

它是将其引入相应的宿主细胞以后

一般我们这个宿主细胞是大肠杆菌

来进行繁殖和克隆

理论上这种群体

就包含了这个物种的

全部的mRNA信息

所以我们称这种生物基因组

叫做cDNA文库

就是先获得它的mRNA

就是RNA然后再反转成cDNA

然后再去构建文库的一种方式

那它的流程也非常简单

从组织

或细胞中

获取mRNA

然后再反转出cDNA

再和这个cDNA和载体进行连接

导入大肠杆菌

或者合适的这种载体的菌株当中

然后鉴定CD文库的克隆

与它的生化特征

表型特征

CD文库有哪些用途

比如有些病毒本身就是RNA的就病毒

所以你不可能去构建它的DNA文库

是基因组文库

所以构建的是它的cDNA文库

像我们可以通过

构建这种cDNA文库

研究甲型肝炎H2减毒株

它是为什么会有这种减毒的特性的

通过分析发现

它5‘端非码区的缺失和变异

是造成甲型肝炎病毒解毒所必需的

就是它5‘端的这种缺失

对它非常重要

就是我们通过对它cDNA文库的

这些携带基因的序列

分析得出了这么一个结论

对于研究这种

病毒的减毒的机理是十分重要的

开发新型的这种减毒的病毒

也是有着理论依据的

还有我们cDNA文库

还可以用于个体发育的研究

就是我们所有的生物体

在生长过程中是

有不同的发育时期的

在这个发育过程中

它的整个的基因组

可能DNA是没有什么变化

但是它的RNA的表型

就是转录出来的mRNA

确实有很大的区别

那我们来以血吸虫为例

看一下

它在幼虫的时期

我们会看到与信号转导

细胞粘附相关的这种蛋白的表达

对应的mRNA会有上调

就是大量表达

而在尾蚴时期

它与运动和能量代谢相关的一些基因

它的mRNA的数量会上调

而在成虫时期

它的蛋白质合成相关的

转运时期的这个蛋白

然后通过这种比较分析

我们就可以看出在这个

血吸虫整个的生命过程中

它的蛋白

或者是

mRNA的表达是一个怎样的变化过程

是以它与这个生长周期

时期的特性是密切相关的

看了这两种文库

我们来进行比较一下

两种文库各有什么特点

比如像基因组文库

它含有了所有DNA的这种信息

所以可以研究编码区以外

调控序列一些结构和功能

而且监控过程不受

这种时间和空间的影响

任何时期因为它的基因组

是没有什么变化的

而cDNA文库

便于克隆和大量表达

因为它本身

就含了一个基因mRNA在上面

所以直接可以用于下游的表达

文库的筛选也简单易行

假阳性的这种概率很低

当然两种文库

都有自己这种天生性的缺陷

对不对

像cDNA文库就是

基因组文库里面

它有内含子是难以表达的

对吧

它是随机切断

所以对于真核生物来说

有的是还有一段内含子基因

有的含有外显子

是这种杂合的状态随机的一个片段

而cDNA文库

它的缺点

就是遗传信息较少

并受细胞来源和发育时期影响

从血吸虫那个例子我们看出

不同时期是有明显的差异的

而且一些低丰度的mRNA

就是说我们体内

对这种蛋白可能需要量很少

所以它转录出来的mRNA

也量非常少

那再做成这种文库的时候

相应的克隆就会非常少

我们剪出的几率就会变得非常困难

这就分离非常的困难

根据文库

这两种文库不同特点

所以在我们从事研究的时候

你要选择合适的文库

来针对你自己的研究

像基因组文库它就特别适合

分析特定的基因结构

还有基因的表达调控

以及构建全基因组的图谱测序

都适合于基因组文库

还有一些遗传信息的保留

特殊物种这种遗传

物质的保存

也可以通过基因组文库来完成

而cDNA文库

它对一些RNA病毒进行研究

那你显然只能用这种方法

还有研究有功能的蛋白序列

因为它本身对应的信息的转录产物

将来是要翻译成蛋白质的

所以用cDNA文库更为合适

还有分离特定发育阶段的

组织特异性的这种表达基因

也是用cDNA文库更为适合的

最后给大家介绍一下宏基因组文库

我们先来看一下

什么是宏基因组文库

所谓宏基因组

我们也把它称为微生物环境基因组

既环境中全部微小物质

微小生物遗传物质这么一个总和

它包含了可培养的和未可培养

就不可培养的这种微生物的

所有的基因都在里边

这就是宏基因组

那宏基因组学是一种以环境样品中

微生物群体为研究对象

以功能基因筛选测序分析为手段的

这么一种研究方式

它主要是以微生物的多样性

种群关系相互间的进化关系

以及功能活性

和有它和环境之间的相互作用

来为研究目的的

这种研究方法

一般是从环境中获取它的样品

然后通过高通量测序技术

或克隆DNA到相应的载体中

进行深入的研究

你看它研究的范围其实非常广泛

可以研究很多环境因素

当然对医学方面

也是人体也是可以进行研究

比如说我们现在非常火的这种

肠道微生物

还有这种牛胃的微生物

环境当中的微生物

水体当中的图样当中的微生物

都可以进行宏基因组学的研究

那对于我们医学科研设计来说

可能我们

学习宏基因组文库

更针对于它对在医学中的应用

那它可以用些哪些方面

比如肠道微生物的宏基因组文库

我们可以进行分析和研究

对比正常人和疾病人群它有什么差别

对吧

还有可以研究口腔微生物

宏基因组研究口腔的一些微生物

是怎样产生耐药的

还可以通过宏基因组文库

来发现一些新感染疾病

或者是一些特殊微生物群体的

它的致病机制

好了

这节课

给大家介绍了各种各样的文库

以及这些文库在我们的医学研究中

它可以行使哪些作用

大家可以结合自己的研究课题

来选择合适的文库来构建你自己的文库

加以应用

这节课就上到这里

谢谢大家