7.6 分子生物学实验微量操作技巧在线视频

同学们 大家好

我是来自中南大学生命科学学院的何海伦

今天要给大家分享的课程是

分子生物学实验中微量操作的一些技巧

其实大家都已经对

生物化学这些实验的

一些技术方法都已经很熟悉了

为什么还要来讲这个课程呢

就是因为可能在大家实验过程中

有些问题是没有注意到的

我们先来看一下

像分子生物学它有一个特点

大家在实际操作中已经感受到了

它的操作特点是什么

就是微量操作特别多

经常我们要用枪来吸

几微升甚至零点几微升的样品

那样这样的小的量

就很容易造成我们的误差

就实验的误差会比较大

我们这个课程给大家介绍就是

如何你在操作过程中

能够避免这些误差的产生

微量操作我们要遵循一个精神原则

这个原则是什么呢

就是批量配置原液

然后准确加样手法

这就是我们一直要贯穿到

这个课程内容里的一个精髓

批量配置原液的原则

就是我们要先配制母液

然后再把它转化成工作液来使用

再一个 如果有多个平行工作液

我们要先配制成这种

大包装的工作液

一个混合的

然后再均匀地

分装到每一个反应当中

这样就达到了把小变大

然后减少误差的一个目的

第二部分 想给大家讨论一下

如何能更精确地

规范你的操作手法

这样避免不必要的误差

比如怎么样加样的时候

体积更为准确

还有所有成分在汇集在一起时

你怎么样混匀是更合理的

这个混匀我们希望遵循的是

先离心再混匀再离心的三步骤

好了 我们这个课程

就分两个部分给大家介绍

首先我们来看一下批量配置原则

所谓批量配置经常情况下

我们说要配置母液的

什么叫做母液

什么叫做母液

就是为了避免每次配制试剂

都要对多种药品进行称量

那将试剂中的各种成分

按原来的若干倍

可能是10倍 可能是50倍

这个倍数来配制成浓缩液

这种浓缩液我们就叫做母液

当我们在用这种浓缩液的时候

也是用母液的时候

我们只要把它稀释就可以了

这个母液我们要遵循下列的配置规则

要一次配置

这样可以多次来使用

从而减少每次称量时候试剂的麻烦

再有有些在这个配制试剂当中

可能有些药品它的量是非常微量的

那我们这样

放大了十倍或者几十倍以后

这个微量的试品在称量起来的

造成的误差就会比较小

因为它的克数变大了

母液配制好了以后我们就保存

在母液配制的配制和保存中

我们要做到准确无误尽量减少误差

首先我们需要用这种

比较精确的称量天平

然后用溶液进行定容

一般是先把药品放在这种容器当中

然后再兑入液体

定容的时候你可以用量筒来定容

当然操作要规范

比如说要拿起来和你的视线齐平

也可以用容量瓶来定容这样更为精确

在这个过程中

我们还要注意它的pH值的调配

你要调到你所需要的

这种pH值然后才能作为

比较配置良好的母液来储存起来

那在母液配置好以后

我们如何进行储存

母液也必须进行妥善的这种保管

比如这种母液是需要避光保存的

你需要用棕色瓶来进行保存

或者甚至用锡纸来进行封存

如果要是低温保存

我们就需要放到冰箱里

还有一定要避免其他的这种

细菌的或微生物的这种污染

造成它的变质

这种变质的母液是肯定不能用的

再有我每次取母液

来配置成我们的工作液的时候

你都要注意用新的枪尖

或者直接往外倾倒

避免交叉造成的这种变质

还有就是我们的母液

如果这种母液比较的昂贵

最好再配置完成以后

立马实现这种分装

分装成若干的这种小的离心管

在每次使用的时候我们就拿出一管来

然后进行稀释

其他可以一直储存在

我们的冰箱里边

减少反复冻融

对样品或者药品来造成的损失

除了母液配制以外

我们有时候实验的时候

工作液要现成的配置

那工作液的配制

我们遵循的原则就是

集中配置 单独分装

为什么要集中配置

就有时候在

尤其是在分子实验操作当中

很多时候它的工作液量

是非常非常少的

比如我们举的这个例子

比较10种化合物

对酶促反应激活或抑制效应

我们看它单管的反应体系

像0.1微升的ATP

还有1微升的非标记的ATP

1微升蛋白这些

都是1微升体积的

如果每次我们都用液器量取1微升

这个误差肯定是非常大的

那怎么办

我们可以采取这种方式来进行添加

因为我们平行可能要做

10到20个管 是不是

所以我们可以先集中的

把这些缓冲液都配置在一起

如果实验10种分子要设置20个反应的话

我们就要预先配置成

20份反应的缓冲液

那这样我们就不添加

0.1微升的被标记的ATP了

我们直接添加2微升

像这种非标记的ATP

我们就直接添加20微升

这样再扩大十倍

最后用水补足到380微升

最后添加我们要检测那个分子就可以了

整个的体积增大以后

就很容易让你操作

而且更为准确不容易出误差

这是在工作溶液上的

一些配置的注意方式

那下面这一部分就给大家介绍一下

就是你在量取液体或者称药品的时候

你怎样才能保证你的手法更为准确

加样更为准确

首先大家要有养成这种

正确使用微量移液器的习惯

这种水溶液或者是有机溶液的吸取

一定要缓慢吸取 缓吸

而且要缓慢地把它放干净

并注意吸与放的时候手法与时机

如果对于这种粘稠度很大的液体

这种大家在实验中其实是经常会遇到的

像你在吸取甘油的时候

或者吸取**的时候

这种液体的黏度都非常大

实验的时候你也会产生困惑或者困难

就是它很容易粘壁

吸量体积不准确

那对于这种液体我们该怎么办

我们可以在吸液之前

反复的吹打几次液体

让这个液枪尖充分的让液体润洗过

若不预洗枪头

需要在放液后

在液体中反复的吸打若干次

让粘的枪尖壁上的这种粘稠的液体

充分地混到液体中

直到内壁上残液充分被冲刷下来为止

甚至我们还可以考虑

因为这个液体太黏了

我们可以用刀或者是剪刀

把这个枪尖前面的头给剪去一点

这样使出口变大

这样可以更利于液体的吸取

其实大家平常实验中不够注意

我们经常在使用移液器的时候

会犯这样那样错误

比如用大量程移液器去吸取小体积样品

你用一个一千微升的枪

去吸取十几微升的样品

这显然是不合适的

会造成的误差比较大

或者是你套吸头的时候用力过猛

很容易造成你的吸液量会过多

还有吸液的时候移液器本身是倾斜的

这样你在吸的时候准确性就变差

一定要注意你的枪

和吸取的液面要保持垂直

还有直接把吸液枪的按钮按得太深了

直接到第二档吸液

这样样品量肯定是吸的过多

还有一些是你松开钮过快

这样会就会造成你吸的液体往上喷

很容易污染你的枪杆

还有吸取的时候

不同液体的时候不换枪头

这会造成你各种液体之间的

就是样品之间的这种交叉污染

还有带有残余液体的吸头

我们就把枪整个的平放在这儿

如果里边的液体是有腐蚀性的

就会枪杆做成这种腐蚀性的损害

还有使用具有强腐蚀性的液体

来清洗移液器

那直接就会把枪搞坏

这是绝对不允许的 对吧

最有就是长时间没有校准移液器

因为这个移液器

它的里边是一个机械原理

就是一个弹簧

如果长时间不校准的话

肯定会产生一系列的误差

那大家如何来解决这个误差的问题呢

其实很简单的

实验室里就可以操作完成

你可以借助电子天平

然后一个烧杯 还有水

用你的枪去吸取水

来称它吸取的液体是否准确

比如一千微升滴到烧杯里

称来是不是一克

如果比较准的话枪就不用校正

如果不准的话

我们就需要用这种小扳手微调一下

再有对于吸取液体的时候

我们还要养成这种良好的加样习惯

由于分子操作

我们经常吸的那个液体量非常少

前面已经讲过了 对吧

像一微升性至零点几微升

那你怎么知道我这个这么少量的样品

确实加到了我的反应体系当中呢

可以采取几种方式

来确保液体已经加入了

比如这种加样到试管壁上

当你把样品靠近液体表面

加样到血管壁上那儿会产生一个

小水滴就是你的样品滴

然后你通过倾倒液体

把它融到你的样品里

这种确保你能够看到 可视化

你就知道你的样品确实加进去了

再有就是我把枪尖

伸到我的要加样的液面之下

这样反复吸打几次

我也确保我的样品

已经加到我的混合液当中了

还要确保我们加样的体积准确

每次要预洗枪头这个大家要注意

特别是这种微量

还有不同的加样体系

你的加样手法要注意

比如说这种一两微升的

你吸取一两微升

要把它升到液面之下去吸取的时候

这个枪尖一定不要伸得过长

可能这个枪尖壁上会沾上大量的液体

一般只要下去一两毫米就可以了

像随着体积的增加

它的下沉的液面可以稍微多一点

还有就是长时间的实验操作

其实你就对液体的量

有一个大体的概念

一个大体的了解

尤其是这种体积量比较大的

像吸一千微升或者是二百微升

吸取的样体

大概的在我们的枪尖里边的位置在哪里

你心里其实是有数的

如果过少或过多

你都会要对自己产生怀疑是吧

重新量取一次是不是枪不准了

还是漏气了

然后再重新的进行量取

当我们把样品都加完以后

你肯定要把样品混匀

那混匀并不是说我们直接用手弹一弹

或者是直接在混合仪上混一下就可以了

其实也是有一个规范的

怎么才能把样品混合的更为均一呢

应该遵循下面三个步骤

第一是先离心让它所有的样品都沉下去

哪怕是夹在管壁上也可以混在一起

再有这时候离完心再混匀

就是把所有的样品混在一起

可以用这种接触式的涡旋器混匀

也可以用手指轻弹混匀

混匀完了以后 我们再离心

把粘在管壁上的全部的

把它都集中在管的底部

这样才完成一个液体的充分的混匀过程

在离心过程有一些注意事项

需要大家注意的

就是肯定要配平

这是作为离心的一个最基本的标准

还有养成方向固定试管的习惯

通常将试管帽的连接柄

始终垂直于放置于试管帽的顶端

这是具体的要求

对离心后分离样品

我们可以采取吸取目的

像到新的试管中这种方式

或者增加样品的稀释度来放大反应体系

来减少相应的目的项的损失

就是因为量太少了

害怕在转移的过程中造成损失

所以你可以通过放大

当然有时候不行

没有办法就直接进行

混匀注意项

需要根据你的样品的特点来进行

有些的时候混匀不能剧烈

像在提DNA的时候

我们只能这种颠倒的缓慢的混匀

有些时候为了方便

你可能手指轻弹混匀

那大部分时候我们可能用涡旋混匀

它混匀的比较均匀

减震的混匀就会

害怕把大的分子来给破坏掉

这是根据你的样品

来采取合适于你实验的

这种混匀方式

以上就是给大家介绍的

就是有关分子操作里

大家需要在配置样品

还有操作手法一些注意事项

希望大家在以后的实验中

对这些细节都有所注意

让你的实验更为准确和精确

这节课我们就上到这里 谢谢大家