6.3 免疫组织化学染色结果评价与非特异染色的控制在线视频

各位同学好

我是来自于中南大学基础医学院

人体解剖学与神经生物学系的熊鲲

今天我和大家一起学习的内容是

免疫组织化学染色结果评价

与非特异性染色的控制

免疫组织化学染色

是指在抗体上结合荧光

或可呈色的化学物质

利用免疫学原理中的抗原和抗体

特异性结合反应的原理

原位检测细胞或组织中

是否含有目标抗原的存在的一种研究手段

根据免疫组织化学染色的原理

可以分成两种方法

其中第一种我们称之为直接法

它的原理就是标记物

标记在特异性的抗体上

也就是第一抗体

第一抗体与抗原直接结合

它是一步完成的

具有简便 省时

特异性强 非特异性染色轻的优点

但是它也具有敏感性差

一种标记抗体只能检测一种抗原的缺点

另外一种染色方法是间接法

间接法的原理是

标记物标记在第二抗体上

第二抗体

结合第一抗体

第一抗体和抗原特异性结合

因此它是两步完成的

像直接法敏感度高

但是比直接法费时

而非特性染色稍微要严重一点

目前我们采用的通常是间接法

免疫组织化学染色方法中

最核心的试剂是抗体

抗体又分两种类型

一种是单克隆抗体

一种是多克隆抗体

下面这一个表显示的是

两种抗体的不同特性

从均一性 稳定性和特异性 重复性

以及沉淀反应来进行分析

那么这个表格两者之间的差别

请同学们在课后来进行学习

抗体可以进行比较长时间的保存

但是要注意如下事项

第一抗体储存容器需要采用

不能吸附蛋白质的材料来做成的

因为一旦这个材料可能吸附蛋白质的话

会把这一个容器里面的抗体全部给吸附

做出来的结果可能是假阴性结果

另外抗体的原液

和已分离的免疫球蛋白组分

可以保存在-20℃的条件下

那么稀释的抗体一般保存在4℃条件下

另外我们为了防止细胞污染

可以在抗体溶液中

加入0.01%的叠氮钠

免疫组织化学的应用

主要在以下几个方面

首先我们来看细胞组织内

是否有待测抗原的存在

它还可以检测细胞或组织内

待测抗原所在的位置

另外就是可以初步的判断

检测抗原在细胞或组织内的

相对含量的高低

我们做出来了免疫组织化学染色以后

我们如何对这个染色的特异性进行评判呢

请注意如下三点

第一点我们可以看到抗原的定位

胞浆 胞核 胞膜或者间质具有结构性

另外是染色的强度不同

染色的深浅不一

第三点是特性的染色和人工假象

通常显示不在同一个平面上

我们来看如下两个例子

左下角的这张图

是显示的神经元的特异性染色

大家可以看到细胞的结构非常的清晰

包括凸起

包括胞浆 胞核

并且不同细胞的染色存在有差异

我们看这一组例子

中间这张图是非特异性染色

大家可以看到阳性细胞遍布都是

而下面这一张图

是通过优化以后的特性染色

我们可以看到阳性细胞

主要标记在淋巴结组织里面

那么对于免疫组织化学的结果评判

我们要注意如下几个方面

第一要设置对照组

第二抗原的表达要在特定的部位

第三阴性结果不能简单的看为抗原不表达

要注意排除假阴性的结果

当然还有4 5 6其他的一些要注意事项

请同学们在课后的时候来学习

刚才我们提到了对照组的设置

我们来看一看

免疫组织化学染色的这个对照组

是为了要排除假阴性或者是假阳性

同时可以确认组织中的显色反应是

是来自于目标抗原

和特异性抗体之间的结合反应

下面我们来看一看几种不同对照组的设置

第一种我们把它称为内源性组织背景对照

有一些组织里面是自己就有一些颜色的

或者有自发荧光

那么我们在上一抗的上样之前

可以利用荧光或者是明视场的照明

对于这个细胞进行检查

以确保这个组织标本本身是没有染色的

没有颜色的

或者是没有这一个自发荧光的

这样可以排除背景的非特异性染色

第二种类型属于组织对照

包括有阳性组织对照和阴性组织对照

阳性组织对照的最简单的

就是我们要采用确认含有

我们要研究的靶标蛋白的

这个组织来作为实验对照

另外阴性组织对照

就是我们要采用我们确认

已经确认不含有我们待测的

靶标蛋白的组织来进行对照

我们来看这张图

对于Pin1这个蛋白而言

上面这组图是确认含有的

所以我们看到它是阳性染色的

而下面这个组织

是一个确认不含有Pin1蛋白的

所以它的免疫组织

免疫荧光化学染色是阴性的

对阴性试剂的对照

我们也分为三种类型

第一种叫空白对照

其实非常简单

就是要用缓冲液

可以是PBS

也可以是TBS

也可以是稀释一抗的血清等

取代第一抗体

然后其它的步骤都跟我们常规的

免疫组织化学是一样的

通过这一个空白对照

我们来排除假阳性结果

另外一种阴性试剂对照是吸附对照

其实吸附对照

就是将一抗和免疫原预孵育以后

然后将这种预孵育以后的抗体

与组织共同孵育

接下来做我们的常规的免疫组织化学

主要是用来排除假阳性结果

请看这张图

这是我们自己这个课题组做的工作

然后这张图是RIP3的免疫荧光化学染色

而这张是把这个RIP用特异性的

这个多肽进行预孵育以后

然后得到的就是一个阴性结果

这就说明这个抗体是正确的

是特异性的结合

第三种阴性试剂对照

我们称为同型对照

在使用单克隆一抗时

可利用与一抗相同亚型的

非免疫原性球蛋白

比如说IgG等来代替一抗

这些也可以排除假阳性

我们看这张图左边的这张图

是正常的免疫组织化学的染色

而这张图是用的IgG来替代的一抗

所以它是一个阴性结果

那么我们对这些不同对照的结果

做了一个配*的表

大家可以通过这些自己的配*表的结果

来对自己染色的结果进行判断

关于免疫组织化学非特性染色的原因

我们也做了如下一个表格

左边的显示这些点是代表的原因

而右边显示代表的是解决的方法

所以课后也请同学们自己来学习

另外假阳性和假阴性产生的原因

我们也分析了

包括比如说有固定原因

切片原因 染色原因等等

那么这张表格也请同学们在课后进行学习

我们接下来用几个例子来看看

免疫组织化学

假阳性和假阴性的原因的产生

首先我们看左边这一组图

这是一个假阳性的染色

我们看到的这些点

是福尔马林的色素颗粒

这都是假阳性的结果

通过调整的方法得到了这些阳性染色

这才是真正的阳性染色的结果

我们再接下来看一个假阴性的例子

上面这张图固定的时间是12个小时

而下面这张图固定的是48个小时

我们可以看到固定时间太长

抗原发生交联

然后得到的阳性产物明显减少

这就是一个假阴性的结果

最后面我们来谈及三个

和免疫组织化学有关的信息和概念

第一个是抗原修复

抗原修复的原因

由于组织部分抗原

在甲醛或多聚甲醛固定的过程中

可能发生了蛋白之间的交联

及醛基的封闭作用

使其失去的抗原性

有可能会出现假阴性的结果

所以我们可以通过抗原的修复

使细胞内抗原决定组重新暴露

提高抗原的检测率

常用的方法包括有如下几种

高压修复 微波修复和胰酶修复等

我们来看看例子

这张图显示的就是

通过抗原修复以后的结果

上面这张图显示没有抗原修复的

大家可以看到阳性染色很浅不明显

通过抗原修复以后

我们可以得到得到了

得到了一个染色非常清晰的

这样一个结果

但是请注意抗原修复

也可能引起非特异性的染色

第二个我们要关注的概念是细胞破膜

为什么要进行细胞破膜呢

因为有时候目标抗原

它是位于细胞内的

我们需要加表面活性物质

比如Triton-100可以使细胞破膜

然后细胞内的抗原充分暴露

这样一抗才能与位于胞内的蛋白发生结合

请注意一点

如果我们用脂溶性的固定剂来固定

比如说酒精 甲醇 丙酮等

我们不需要再对细胞膜进行破膜了

因为这些脂溶性的固定剂

已经破坏了细胞的脂质双层膜

最后一个我们要关注的是组织芯片

组织芯片是将十几个

几十个甚至上千个小组织

按照设计整齐的排放在一张载玻片上

制成的一个组织芯片的技术

这种技术是继基因芯片 蛋白芯片后的

又一种生物芯片技术

组织芯片和免疫组织化学相比

它具有高通量 平行性和科学性的优点

而这些优点恰恰是咱们的

常规免疫组织化学技术所不具备的

今天我们的内容就学习到此

谢谢大家