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同学们好

我是来自于清华大学医学院的老师郑撼球

今天我们说的内容是

P53蛋白和细胞凋亡通路

首先我们说一个概念

就是整个宇宙之中呢

其实没有什么是一成不变的东西

包括我们说的这宇宙中的星系和恒星

它们都在发生着新生或者是死亡

那么对于我们个体来说呢

其实在正常的发育过程中

也有很多的细胞凋亡的过程

在细胞生长的过程中

其实有其中一部分细胞

也会发生细胞凋亡

比如说我们看到的这幅图里面

这是一个在胚胎发育过程中的

一个手或者是脚的一个形态

你能够看到呢

在每个手指的正中间呢

有很多的细胞其实正在发生着凋亡

如果这些细胞不去发生这些凋亡的话

我们可以想象

这些我们所有的手指或者是脚趾

其实会连在一起

那么我们要说一下

在整个的细胞凋亡的通路过程中

最重要的一个蛋白

可能就是我们下面要说的这个蛋白

叫P53蛋白

它其实起着非常多的重要的作用

最重要的一个功能可能是

维护着基因组的稳定性

同时呢

它会在一定程度上

诱使细胞发生细胞凋亡

我们会一步一步的去说一下

P53蛋白在细胞中发挥着的作用

那么P53蛋白是怎么被发现的呢

其实是一个非常有意思的过程

前面也可能说过

就是在很多的

病毒诱导的癌症发生过程中

会导致一些基因的变化

在这个过程中呢

P53就是这样被发现的

在这幅图里面我们所展现出来的呢

是由其中的病毒所编码的一个蛋白叫SV40

Large T 所诱导出的

小鼠的自发乳腺癌模型

能够看到呢这些黑色的细胞

其实是被用免疫染色染出来的

SV40这个蛋白

在这个过程中呢

我们发现如果我们用SV40这个蛋白的抗体

去把SV40蛋白抗原拉下来

我们能够看到一个

94千道尔顿的一个蛋白条带

但同时呢

和它相互作用的另外一个蛋白

也同时被在免疫沉淀中拉下来

这个蛋白的大小呢

是比54KD稍微小一点点

差不多是53KD的大小

于是呢这个蛋白

就被命名成了P53蛋白

那么P53蛋白在细胞中

究竟有什么样的功能呢

有这样的一个实验

首先证明了它其实在一定程度上

是能够抑制正常的细胞的恶性转化

比如我们知道ras这个基因

能够导致细胞发生癌变

在这样的一个实验中呢

它如果发生癌变之后的这些细胞

其实能够长出一个一个的克隆

也就是我们在这个图上

看到的一个一个的小点

那么如果我们把ras和P53蛋白

一起转到细胞之内的时候呢

我们其实看到呢

其实并没有任何的克隆能够长出来

但是如果我们用P53缺失突变的这个突变

我们能够看到呢

能够长出一定程度的克隆

如果我们用另外一个P53特异性的突变

第135位的缬氨酸的突变的时候

我们就看到

它会长出大量的克隆

这就告诉我们P53本身是一个

抑制肿瘤恶性转化的重要的因子

但如果它突变之后呢

在某些特定的位点上

它其实是能够促进肿瘤的发生的

现在我们知道呢

其实在各种各样的人类肿瘤之中呢

P53基因可能是突变频率最高的一个基因

从我们这张图上可以看到

不管是卵巢癌结直肠癌

还是头颈癌食道癌

甚至是肺癌之中呢

P53蛋白的突变频率都是非常高的

都超过了30%以上

在癌症的频谱之中呢

其实是非常高的比例

在其他的各种癌症之中呢

P53也有一定程度的突变

那么P53基因敲除的小鼠

会有怎样的表型呢

我们知道我们研究任何一个基因

很多时候都会把这个基因

在小鼠身上做一个全身性的敲除

然后去看这个基因的缺失对发育

或者是对肿瘤生长有什么样的影响

我们在这幅图里能够看到呢

P53野生型的小鼠呢

它生长是非常正常的

几乎没有发生肿瘤

但是如果缺失了一个拷贝的P53基因之后呢

这个小鼠在300天之后呢

逐步有少部分的小鼠

会发生自发的成瘤现象

那么如果两个拷贝的P53全部缺失之后呢

就会产生大量的肿瘤

在50天到250天之内呢

绝大部分这些小鼠呢

都会产生淋巴细胞癌和肉瘤

最终导致这些小鼠的死亡

这里面有一个非常有意思的事情呢

就是我们可以从一定的突变频谱上

就能够识别

这个基因到底是促进癌症生长的基因

还是抑制癌症生长的基因

这个理论呢其实是由一个

约翰霍普金斯大学的教授叫Vogelstein

在2013年的Science发表出来的

我们从这张图上就能看出来

这是什么意思

上面的两个基因呢

一个叫PIK3CA

另外一个叫IDH1

你能够看到一个非常有意思的现象呢是

它的突变都非常集中在某些特定的位点上面

能够看到每一个点呢

其实代表的是一定的突变频率

你能够看到PIK3CA

还是IDH1之内呢

在基因上面呢

都会有某些特定的点

它会有非常非常多的突变

都在这个点上面

那么下面两个蛋白呢

一个叫RB1

一个叫VHL

你能够看到它的图片呢

其实是非常均匀的

分布在这个基因编码序列的各个位点上面

这说明什么呢

这说明上面两个基因

很有可能是一个促进癌症生长的基因

我们把它叫做促癌基因

而下面两个基因呢

非常有可能是抑癌基因

为什么这么说呢

我们可以想象一下

如果一个基因是促进癌症生长的基因

那么当它发生突变的时候呢

它其实需要获得一些

更有价值的促进细胞生长的功能

所以它突变是要非常特殊的位点上

来获得一些新的功能

或者是让某些功能增强

所以它的突变是非常集中的

而如果一个基因是抑制癌症生长的基因呢

那它的突变呢

其实可以在任何一个位置上

只要让这个基因失活

那么它的抑癌功能就消失了

所以直接从突变频率上和突变的位点上

你就能大概猜测出一个基因

可能是促进癌症生长的基因

或者是抑制癌症生长的基因

那么P53蛋白的突变到底是什么样的呢

那这张图谱上给你稍微展示了一下

我们能够看到呢

首先P53在很多位点上

确实是有非常多的突变的

这在一定程度上首先说明了这个基因

很有可能是一个抑制癌症生长的基因

也就是抑癌基因

但是呢它还有几个特殊的位点

它的突变频率也是相当的高

我们后来的研究呢也发现

在这些位点上的特定突变呢

其实是会导致这些基因产生一些新的功能

产生一些所谓的促进癌症生长的效果

所以它是某种意义上来说

是两个功能的结合

所导致出来这种突变频谱的现象

那么P53基因的失意突变和缺失突变

它的后果其实在肿瘤细胞中是不一样的

它为什么会产生这样的结果呢

其实是有一定的原因的

P53蛋白它不是一个单独的蛋白来发挥作用的

其实它是通过四个同样的P53的集团

结合到一起

产生一个所谓的四聚体

最终来发挥它的功能

所以这时候大家就可以想象一下

如果P53这个基因

只是发生了一个缺失突变

那么它所产生的后果是什么呢

是它只有一个完整拷贝的野生型P53蛋白

在这种情况下呢

它只是它的量减少了1/2

在一定程度上

它的功能仍然还是发挥着比较好的

和野生型相似的功能

再另外一点呢

如果P53基因发生了失意的突变呢

这种情况下会怎么样呢

它的结果是

它有一个拷贝是正常的野生型的P53蛋白

而另外一个拷贝呢

其实是一个错误的没有功能的蛋白

但是它们会形成四聚体

所以从概率上来说

15/16的这些四聚体

都会包含一个或者是更多的

发生错误的这个P53拷贝

只有1/16的是完完全全的野生型的P53

这样的后果是

它其实理论上讲只保留了

1/16的P53蛋白的功能

也就是几乎接近于零

几乎完全没有P53的功能

那么P53蛋白到底是怎样产生表达和调控的呢

我们首先要知道的是

P53其实是一个

所谓的跟环境中的压力

做应激反应的一个蛋白

所以在这里面我们会知道

当DNA或者是基因组发生了错误

或者是有问题的时候

比如说DNA发生了双链的断裂的时候

同位素或者是紫外线照射

导致的这些DNA的损伤的时候

DNA损伤会激活一些下游的信号通路

最终会导致P53蛋白的积累

那么同样的呢

比如说我们刚刚说的紫外线照射

会形成核糖核酸的二聚体

这也是一种DNA的单链损伤

在这种情况下呢

DNA复制过程中

会导致停滞的DNA复制差

最终会导致细胞内的P53蛋白的表达

那么其他的一些信号呢

比如过度增强的生长信号

特别是细胞周期调控中的RB蛋白

和E2F的信号

细胞能够感受到的多种压力

如营养缺失或者是缺氧条件呢

也能够诱导细胞产生P53的表达

或者是细胞内的积累

这张图基本上总结了

我们刚才说的各种促进P53蛋白表达的因素

在P53蛋白激活之后呢

首先是导致细胞周期的停滞

帮助细胞内DNA的修复

那么如果可以完成这样的修复呢

细胞则可能存活下来并开始继续分裂

如果损伤过于严重无法修复的时候呢

则会导致细胞的衰老和凋亡

这可能对大家来说显得不是很形象

我们可以举两个生活中的例子

大家就比较好理解

这个过程中P53的作用了

首先我们举一个例子呢

就是在夏天大家如果出门

没有做好防晒措施

我们胳膊上的皮肤呢会被晒红

甚至会发生局部的皮肤坏死

发生脱皮

这其实就是P53蛋白在起作用

在阳光中的暴晒呢

会让皮肤上上皮细胞

吸收了过量的紫外线

这会导致DNA碱基之间呢形成二聚体

和DNA单链的损伤

从而导致P53蛋白的上调

如果最终无法完成DNA的修复呢

就会激活细胞凋亡的程序

也就是我们看到的脱皮现象

那么另外一个例子呢

就是在女性备孕或者是怀孕过程中

需要补充叶酸

也就是维生素B9

这可以大大降低一些神经管畸形的发生率

一种可能的推测

是因为怀孕或者是胚胎发育过程中

需要大量的核糖核酸

而叶酸的衍生物

正是参与了核糖核酸

也就是嘌呤和嘧啶碱基的合成

如果缺少了叶酸呢

可能会导致碱基的缺乏

从而激活P53通路

并导致细胞的凋亡

从而影响到正常的胚胎发育过程

我们看一下

在同位素照射之后

P53蛋白表达能有多少变化

这张图表现出来的呢是

在8个小时和24小时之后

P53和它的一个下游基因叫P21

它是一个细胞周期的抑制因子的表达情况

我们能够看到的是呢

在8小时和24小时之后呢

P53蛋白会非常迅速的被升高

而P21这个蛋白呢

会在24小时的时候

表达量显著的升高

这就说明呢

P53确实能够被同位素辐射

也就是DNA损伤所诱导表达

那如果我们把这个细胞中的P53蛋白

敲除之后会发生什么现象呢

我们能够看到的是

野生型和杂合

以及纯合的P53的这些细胞

在受同位素照射之后

它的存活情况是完全不同的

我们看到呢

在有野生型P53的情况下呢

T细胞会发生细胞的凋亡

而只有非常少量的细胞存活下来

在P53完全缺失或者是部分缺失的情况下呢

这些细胞大部分都能够存活下来

那么P53到底是怎么样被调控的呢

这里面就涉及到他的另外一个调控因子

这个因子呢其实是MDM2

这个MDM2蛋白

是一个可以和P53蛋白

转录激活区域

也就是第17位到第27位的氨基酸

相互作用的一个蛋白

而MDM2本身呢

它是属于一个E3泛素连接酶家族的蛋白

它能够泛素化和降解与它相互作用的底物

在这里呢也就是P53蛋白

从而导致其蛋白的迅速降解

MDM2和P53蛋白的相互作用

会做下面这三件事情

第一件事情呢

是抑制P53转录因子的转录激活

第二个功能呢是泛素化P53蛋白

并导致其最终的降解

第三个功能呢

是促进P53蛋白的出核

而这也是降解的必要步骤

那么我们可以看一下P53小鼠呢

我们之前也说过

P53敲除的小鼠是能够完全正常出生的

但是如果MDM2被敲除之后呢

会导致P53的大量升高

从而导致小鼠的致死

如果我们把MDM2和P53同时敲除的话

小鼠又能够正常的出生

这张图其实就是总结了

我们刚刚说的MDM2的作用

在核内的时候呢

MDM2会和P53蛋白相互作用

并泛素化P53

帮助P53出核

最终让P53发生泛素化降解

因为这个原因呢

其实很多科学家呢也尝试着

去发现一些MDM2和P53相互作用的抑制剂

比如说这里所提到的一个分子叫Nutlin

它能够抑制MDM2功能的小分子抑制剂

在体外和小鼠实验上

能够表现出很好的抑制肿瘤生长的作用

但目前还没有完全进入最后的临床批准

P53蛋白的调控

其实是不仅仅止于

我们刚刚说的MDM2的调控

其实它还有其他非常多的调控因子

比如说我们知道在DNA损伤之后

会激活一些所谓的ATM和ATR

以及CHK1/2的蛋白激酶

这些激酶的作用呢

是去磷酸化P53和MDM2

来抑制它们的相互作用

另一方面呢

如果MDM2被细胞存活的信号通路

比如说Akt/PKB的下游信号通路所激活

能够磷酸化MBM2的

另外的一些磷酸化的位点

从而MDM2和P53的结合会增强

促进P53蛋白的泛素化

并帮助P53出核和降解

那么MDM2和P53呢

其实是一个负反馈的机制

我们刚刚说的是MDM2

是P53的泛素化连接

酶负责它的降解澳

但是另外一方面呢

MDM2也是P53蛋白的下游靶基因

也就是说P53蛋白

其实可以结合到它的启动子区域

促进MDM2的mRNA转录

这样其实形成了一个完整的负反馈回路

能够帮助我们精确的调控

P53蛋白的表达量

因为MDM2虽然是P53的下游靶基因呢

它的诱导时间呢相对较晚

也保证了P53蛋白能够有足够的时间

去行使它正常的功能

此外呢还有一个蛋白

在这里我们要提一下

在人之中呢这个蛋白叫P14

在小鼠之中的这个蛋白叫P19

但是它的另外一个名字叫ARF

这个蛋白能够结合MDM2

这个结合的作用呢

是导致MDM2

无法发挥其泛素化降解P53蛋白的功能

从而保护了P53蛋白

而在很多细胞生长存活的蛋白因子

是可以促进ARF的表达

并且抑制MDM2的功能的

这里有这样的一个实验呢

当我们去过表达了一个上游的基因

叫E2F因子之后呢

ARF会被高表达

而ARF表达之后呢

会有很多细胞

在这里其实是发生了细胞的凋亡

这是保护细胞在收到过度的细胞生长信号的时候

避免转化为癌细胞的一种机制

那我们总结一下呢P53蛋白的功能呢

它其实作为一个转录因子

它行使功能的方式

主要是通过结合到下游基因的启动子序列上

并激活这些基因的mRNA转录

而这些下游基因主要的功能

包括下面两个主要的大的方面

第一个呢是在有DNA损伤

或者是其他压力环境下呢

阻止细胞周期的进程

此外呢是在无法完成修复的情况下呢

能够激活细胞凋亡的信号通路

促进这些DNA已经发生损伤的细胞

进行细胞的凋亡

P53蛋白去调控下游基因的时候

是有启动子序列的选择性的

这里我们画出来的是

它启动子DNA的序列选择性

我们够看到呢

它特异性的选择结合20个碱基序列

其实是两个重复的序列构成的

每一个重复序列大概有十个碱基

在这上面图上碱基写得越大

表示它相对应的位置呢

对该碱基的选择性越强

比如说这上面的第四个碱基的位置

百分之百的就会选择C

也就是胞嘧啶这个碱基

而它的第七位这个碱基呢

百分之百的会选择G这个碱基

也就是鸟嘌呤

而其他的位置上它可能会有

2到3个不同的碱基可以供它选择

但是选择性是强度是不一样的

那么我们能够全基因组的

去测定P53下游的基因

做法是这样的

细胞在接受了同位素辐射

或者是紫外线照射之后呢

会迅速的积累P53蛋白

诱导下游基因的表达

而我们就可以通过基因芯片的方法呢

对基因组里的所有基因进行检测

在这里呢我们其实是对基因组中

6000个检测到的基因进行了分析

其中呢有107个基因呢

能够被P53诱导上调

有54个基因呢

能够被P53蛋白抑制表达

并且呢这些基因可归为三大类

第一个大类呢

就是一个单独的基因

就是负反馈的MDM2基因

能够看到当P53表达之后呢

它能够促进MDM2的表达

从而进一步负反馈到自身

帮助它降解P53蛋白

那么另外一个大类呢

是细胞周期的抑制因子

当发生DNA损伤的时候呢

它首先做的事情呢

就是让细胞的周期停顿下来

不要让这些细胞再进行生长

那么第三大类的是细胞凋亡的因子

比如说这里面的Bax和Puma等蛋白

是在当DNA损伤无法修复的时候呢

就会P53来激活这些细胞凋亡因子

帮助细胞进行死亡过程

有一个家族的遗传病呢

叫利弗劳梅尼综合征

英文叫Li-Fraumeni disease

这个家族呢是有P53蛋白的遗传突变

当这个家族有这样的突变之后呢

这个家族内呢会有很多人得癌症

这是一张家族遗传的图谱

正方形表示的是男性

圆形表示的是女性成员

家族成员继承了P53的突变基因

会发生各种各样类型的癌症

每一种颜色呢

其实是代表了一种癌症的基因

绿色的我们能够看到是乳腺癌

黄色的是胶质母细胞瘤

而紫色的是淋巴瘤

红色的是肉瘤

蓝色的是肺癌

橘红色的是胰腺癌等等等等