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免疫分析法（一）

体内药物与毒物的分析方法：光谱法、色谱法、免疫分析法、电化学分析法、微生物法以及各种联用技术，比如气质联用、液质联用等。

免疫分析法副本.png

免疫分析法（Immunoassay）指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法。已逐渐发展为一门独立学科，主要包括放射免疫分析法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、时间分辨荧光免疫分析法等。

免疫分析法可用于测定蛋白质、酶等生物大分子物质，还广泛用于测定小分子药物。

抗体与抗原即药物结合时具有专一性和可饱和性。当反应体系中存在一定量的特异抗体时，体系中的标记抗原（即标记药物）与未标记抗原（即待测药物）会与特异抗体发生竞争结合，标记抗原-抗体的结合率随着待测药物的增加而减少，我们可以建立这种药物浓度和响应值之间的定量关系，用于体内药物分析。

三种试剂的作用：

1）抗体：是作为标记药物和非标记药物竞争结合的蛋白；

2）标记药物：提供可检测的信号；

3）非标记药物：在标准曲线制备时是药物标准品，它用于建立被测药物量（浓度）与响应值之间的函数关系，供建立标准曲线，是样品中药物浓度计算的依据。非标记药物在未知样品中则为被测药物。

抗原-抗体反应时，须满足以下条件：

①标记抗原与未标记抗原即待测物必须是相同的生物活性物质；

②加入标记抗原和特异抗体的量应是固定的；

③标记抗原与未标记抗原的量之和应大于抗体的结合位点；

④标记抗原、未标记抗原及抗体须处在同一反应体系中。

竞争抑制曲线.png

竞争抑制曲线，也称剂量反应曲线，进行实际样品的浓度测定。

具体做法：

第一步，先用待测物的标准品配置一系列已知浓度的标准溶液．再加入一定量的标记抗原和抗体，待抗原抗体反应达到平衡后，测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率。结合率的计算公式如下：

图片1.png

第二步，以标准抗原Ag的浓度为横坐标，以结合率（B％）等为纵坐标绘制标准竞争曲线。

第三步，取待测样品，按同法操作，根据样品中标记抗原-抗体结合率，即可从标准曲线上查出相应的待测物的含量。

抗原-抗体反应.png

●特异性，即一种抗原分子只能与特异抗体发生特异性结合反应。

●抗原与抗体的特异性结合具有可逆性。

●最适比例性。

免疫分析法的基本条件.png

抗体（Ab）、标记抗原（标记药物，Ag*）和非标记抗原（非标记药物，Ag）三种试剂是所有免疫分析必需的基本试剂，也是任何免疫分析试剂盒应提供的试剂。

抗原（Antigen，Ag）是指能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质。

全抗原指同时具有免疫原性和抗原特异性的物质。作为全抗原的物质其分子量必须足够大，一般要求分子量>1000，且要求化学结构较复杂，如蛋白质、多肽等。

半抗原指只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质.

人工抗原指小分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全抗原称为人工完全抗原，简称人工抗原。人工抗原直接免疫动物可产生特异抗体。

特异抗体是指抗原（免疫原）作用于机体产生免疫反应，在血清中产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体具有高度的特异性，一般只能与相应的抗原起专一的反应。在免疫球蛋白中，免疫球蛋白G（IgG）含量最高，约占70％，是免疫分析中最常用的抗体。

抗体分为单克隆抗体和多克隆抗体两大类。

单克隆抗体是将预先免疫过的小鼠脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞，经细胞融合技术而得到的杂交瘤细胞。该瘤细胞通过体外培养，可大量复制，产生出特异的结构相同的均质抗体。

多克隆抗体是将抗原直接免疫动物而得到。是一种变化着的，非均质性的混合抗体。

免疫分析法的方法分类.png

●按标记物的种类分：

•放射免疫分析（RIA)

•酶免疫分析（EIA）

•化学发光酶免疫分析（CLEIA）

•荧光免疫分析法（FIA）

●按是否加入分离剂分：

•均相免疫分析在抗原-抗体反应达到平衡后，无需将反应液分离，即可区分检测结合的标记药物与游离的标记药物信号。

•非均相免疫分析，需要再反应液中加入分离剂，将游离与结合状态的标记药物分开后才能检测标记信号。

放射免疫分析.png

放射免疫分析（英文缩写，RIA）是利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术，为非均相免疫分析。

特点：灵敏度高、特异性强、样品用量少、标记物容易制备、放射性强度容易检测，特别适合复杂样品中微量或痕量物质的分析。

放射性同位素是指能自发发生核衰变，发射出射线，如α射线、β射线、 γ射线等而变成其他元素的不稳定同位素。这些射线可以被仪器检测到，比如氚能发射β射线，可用液体闪烁计数法检测，能发射γ射线，可用γ计数器检测。

经常用来标记抗原的放射性同位素有、、、等，应用较多的是和。

1)的特点：①化学性质活泼，易于标记；②标记物在衰变中放出的-射线能量较高，易于测定；③标记物的放射线半衰期相对较短，须经常标记；④碘原子的半径较大，标记后可改变药物的化学结构或掩盖药物分子的特异功能基团，易使药物分子的抗原性受到影响。

标记方法：用取代反应标记在药物或药物的衍生物上

2)的特点：①用标记后的药物可获得较高的放射性比度；②标记后的药物的抗原性不会受到影响，因为氢原子的半径较小，且只是与药物分子的1H发生交换，不涉及化学元素的改变；③的半衰期很长，可达12～16年；④发射出的射线能量较低，须采用价格较贵的液体闪烁计数器才能测定其放射性强度。

标记方法：

非定位标记:通常采用气体曝射法，即将药物与氚气密封在一起，放置几天或几周，使与药物分子的发生交换。标记物的位置不定。

定位标记：通常采用特殊的合成路线，即先将引入药物分子结构中的指定位置，制成含有不饱和双键的标记药物前体，然后再对双键部位进行催化加氚。

放射免疫分析法属于非均相免疫分析法，必须先将游离的标记药物和结合的标记药物分离后才能测定各自的放射性强度。所以，分离的方法往往决定实验的成败。常用的分离方法主要有沉淀法、吸附法、固相法和双抗体法等。

放射免疫分析法的标准曲线（或称剂量反应曲线）的绘制方法.png

1. 取标准抗原，用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5～8个系列浓度。

2. 加入定量标记抗原，其总放射性（T）应能满足准确测量的需要。

3. 加入定量的已稀释好的特异抗体，其抗体的量应满足灵敏度的要求。

4. 将标准抗原、标记抗原、特异抗体与缓冲液混匀后，在适当条件下温育，待反应平衡后测定总计数率（T）。

5. 采用适当方法，使结合部分（B）与游离部分（F）分离。

6. 测定各管结合部分或游离部分的计数率。

7. 绘制标准曲线

标准曲线通常以标准抗原（待测药物标准品）的浓度为横坐标，以结合率（B％）为纵坐标作图。

样品测定步骤与上述标准曲线制备项下的操作基本相同。根据标准曲线或回归方程，便可求得样品中待测药物的浓度。

体内药物与毒物分析课程列表：

1.绪论

-1.1体内药物分析相关的基础理论概述

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体内药物与毒物分析课程列表：

1.绪论

2.体内药物分析相关的基础理论概述

3.生物样品的制备和预处理

4.生物样品分析方法的建立与验证

5.色谱及其联用技术

6.免疫分析法

7.前沿分析技术

8.典型药物的体内分析

9.典型毒物的体内分析

10.典型毒品的体内分析

11.禁毒关键技术虚拟仿真实验

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