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色谱质谱联用技术及其在生物样品分析中的应用

将色谱的高效分离能力与质谱的高专属性、高灵敏度的检测功能结合起来，可以实现对复杂混合物更准确的定性和定量分析。

色谱-质谱联用技术已经成为代谢产物的定性与定量分析、药代动力学、毒代动力学、治疗药物检测、法医分析等领域最强有力的分析工具。

色谱-质谱联用技术包括：

·气质联用（GC-MS）

·液质联用（HPLC-MS）

·毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）

LC-MS 副本.png

LC-MS的基本组成包括：液相色谱系统、样品导入系统、离子源、质量分析器、离子检测器、真空系统和计算机系统。

液相的流动相为液体，而质谱要求在高真空条件下操作，因此接口和离子化方式至关重要。液质联用的发展可以说就是接口技术的发展。

接口的作用主要有：

①将流动相及样品雾化，分离除去大量的流动相分子；

②完成对样品分子的电离。

目前商品化的LC-MS常用接口主要为大气压离子化接口 (API)。

API不仅是一种好的接口技术，同时也是一种离子化方式。

API的常用操作模式包括：

·电喷雾离子化（ESI）

·气动辅助电喷雾离子化

·大气压化学离子化（APCI）

ESI和气动辅助ESI原理.png

气动辅助ESI原理同ESI，只是最初液滴的形成借助了气流雾化的帮助。

样品溶液通过具有高静电梯度的喷雾毛细管时，发生静电喷雾，并在干燥气流中生成带电雾滴，随着溶剂的挥发，分析物形成气态离子，气态离子沿着电压和压力梯度进入锥孔到达质量分析器。

在某些设计中，加热的氮气被当作气帘气直接从质量分析器的入口处吹出，可以进一步去溶剂化并防止溶剂进入质量分析器。

生成带电雾滴过程.jpg

生成带电雾滴过程1.jpg

在电场作用于毛细管时，如毛细管为正极，溶液中的正离子移向毛细管尖端，负离子以相反的方向移动。

在毛细管尖端累计起来的阳离子向阴极迁移的过程中受到表面张力的制衡，形成了Taylor锥。

但电压足够大的时候，液体从Tayler锥中释放出来，并进一步裂解成许多细微的带电雾滴。

雾滴变小和气相离子形成过程.jpg

雾滴变小和气相离子形成过程1.jpg

带电雾滴随着溶剂的蒸发而缩小，而雾滴电荷不变，从而导致电荷的斥力的增加。

当静电斥力大于表面张力时，雾滴发生裂解，喷出许多小的雾滴，称为“库仑爆炸”。

溶剂蒸发和库仑爆炸的协同作用使液滴持续裂变，最终形成完全脱溶剂的分子离子。

ESI的影响因素.jpg

离子化过程受多种因素的影响，应对实验条件进行优化，获得稳定而灵敏的质谱响应

(1）离子化程度：与待测物的pKa和溶液的pH有关。

ESI过程是将离子从溶液中转移至气相的过程，使待测物在溶液中成为离子状态，可以提高生成气相离子化效率而提高检测灵敏度。

碱性化合物：通过加入挥发性弱酸如甲酸，调节流动相 pH在待测物的（ pKa-2）左右，有利于分子的质子化，质谱采用正离子检测模式

酸性化合物：理论上通过加氨水，调节流动相的 pH在待测物的（ pKa+2）左右，使待测组分形成负离子，质谱采用负离子检测模式。

但在实际工作中，往往在流动相中添加少量的乙酸或甲酸（一般在0.05%以下），这是基于色谱分离的考虑，微弱的酸性可以改善酸性物质的色谱行为，峰形对称且更加尖锐，而且可提高其色谱保留。

(2）流动相的性质

·常用甲醇-水或乙腈-水系统作为流动相。

·磷酸盐、枸橼酸盐等非挥发性盐和离子对试剂与LC-MS不相匹配，需用挥发性添加剂代替，譬如甲酸、乙酸、氨、醋酸铵、甲酸铵等。

(3）流动相的流速

降低流动相流速，有利于产生细雾滴，从而有利于产生气相离子，提高响应灵敏度。

高流速时，需采用气动辅助装置提高雾化效果，或采用柱后分流。ESI是浓度型检测器，柱后分流不影响灵敏度。

API的常用操作模式包括：

·电喷雾离子化（ESI）

·气动辅助电喷雾离子化

·大气压化学离子化（APCI）

APCI与ESI区别：

增加电晕放电针，发射自由电子并启动后续的离子化过程。

增加APCI蒸发器，对喷雾气体进行加热。

APCI的原理

* 在大气压条件下，采用电晕放电的方式使流动相离子化，然后流动相作为化学离子反应气（气相试剂）使样品离子化。

APCI适用于非极性或中等极性的小分子的分析，对热不稳定或难于气化的极性化合物不适用。

ESI约占实际使用的90%以上，适于用中等极性到强极性的化合物，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子。

APCI与ESI均属于软电离，主要形成准分子离子，如M+H、M+Na、M+K、M+NH4等。

APCI适用于非极性或中等极性的小分子的分析，对热不稳定或难于气化的极性化合物不适用。

ESI约占实际使用的90%以上，适于用中等极性到强极性的化合物，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子。

APCI与ESI均属于软电离，主要形成准分子离子，如M+H、M+Na、M+K、M+NH4等。

总结.jpg

·本讲介绍了色谱-质谱联用的优点与应用范围。

·重点介绍了接口和离子化方式，包括ESI和APCI的原理、影响因素以及区别。

思考题.jpg

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体内药物与毒物分析课程列表：

1.绪论

-1.1体内药物分析相关的基础理论概述

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体内药物与毒物分析课程列表：

1.绪论

2.体内药物分析相关的基础理论概述

3.生物样品的制备和预处理

4.生物样品分析方法的建立与验证

5.色谱及其联用技术

6.免疫分析法

7.前沿分析技术

8.典型药物的体内分析

9.典型毒物的体内分析

10.典型毒品的体内分析

11.禁毒关键技术虚拟仿真实验

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