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免疫分析法（二）

酶免疫分析法.png

酶免疫分析（EIA）是以酶作为标记物的免疫测定方法。该法与RIA的不同之处是用具有高效专一催化特性的标记酶代替了放射性同位素标记物。

酶免疫分析将抗原抗体特异反应和酶的高效催化作用有机结合，具有灵敏度高、特异性强、无放射性污染、操作简单、快速、易于掌握和易推广普及。目前已广泛被用来测定体液中的药物和激素。

在酶免疫分析法中，标记酶的选择非常重要，

最常用的标记酶有：

1、辣根过氧化物酶，约有50％的EIA使用此酶

2、碱性磷酸酯酶

3、6-磷酸葡萄糖脱氢酶

4、β-半乳糖苷酶

5、苹果酸脱氢酶

酶的底物选择.png

酶免疫分析的测定最后都是通过酶与底物反应所产生的颜色深浅来进行定量分析的，所以对应酶的底物选择也很重要。

合适的底物应具备以下条件：

①无色、无毒能溶于水；

②化学性质稳定、不受光照的影响；

③转化率高，在酶催化下可产生大量的有色物质；

④显色产物的量在一定范围内与酶的浓度或活性成正比；

⑤应有终止酶反应的试剂。

●辣根过氧化物酶常用的底物有：

①邻苯二胺；

②5-氨基水杨酸；

③四甲基联苯胺及其硫酸盐。

●碱性磷酸酶常用的底物有：

①对硝基酚磷酸盐溶液；

②4-甲基伞酮基-磷酸盐。

酶免疫测定法的灵敏度主要取决于酶标药物的酶活性和免疫活性，因此，酶标药物的制备成为酶免疫分析的关键。

酶标药物的制备可利用药物分子上的羟基、羧基、氨基、酚羟基等与标记酶分子上的氨基、羧基及其它基团相连接。

酶免疫分析法按照是否需要将结合的酶标药物与游离的酶标药物分开，可分为均相酶免疫分析和非均相酶免疫分析。

均相酶免疫分析.png

均相酶免疫分析是指酶标抗原（）同抗体（Ab）结合后，所形成的酶标抗原-抗体结合物（-Ab）可使酶的活性发生改变（增强或减弱），且不需将游离的酶标药物（）与结合的（-Ab）酶标药物分开，就可直接通过测定酶活性的变化，求出样品含量的方法。

酶增强免疫测定技术（EMIT）法测定原理：

EMIT法使用6-磷酸葡萄糖脱氢酶作标记酶，标记在待测药物上。

图片1.png

在辅酶I的参与下，该酶能将底物6-磷酸葡萄糖氧化成6-磷酸葡萄糖酸，而辅酶I本身被还原成还原型辅酶I。

图片2.png

测定时，首先将未标记药物（待测药物或药物标准品Ag）与抗体、辅酶Ⅰ（NAD）及底物（G-6-P）混合，生成抗原-抗体结合物Ag-Ab。然后加入酶标药物（），此时，酶标药物与未标记药物互相竞争有限量的抗体（Ab），当这种竞争结合反应达到平衡之后，则有部分酶标药物与抗体相结合，从而使结合酶标药物上（-Ab）的酶活性受到抑制，不能再同底物发生作用，而只有游离酶标药物（）上的酶才有活性，能作用于底物产生测定信号。如果样品中待测药物的浓度越高，则竞争抑制的结果使游离酶标药物的量增多，亦即酶的活性随着待测药物浓度的增加而增强，有“酶增强免疫技术”之称。由于游离酶标药物量的增多，能使更多的NAD参与氧化反应，生成更多的酶反应产物NADH。根据NADH在340nm处有紫外吸收的原理，便可用分光光度计测定吸收度，求出待测药物的含量。

非均相酶免疫分析.png

非均相酶免疫分析的原理：

非均相免疫分析是指酶标抗原（）同抗体（Ab）结合后，形成的酶标抗原-抗体结合物（-Ab）与游离的酶标抗原（AgE）一样，其标记酶都具酶活性。因此必须将结合的酶标药物（-Ab）与游离的酶标药物（）分开后，再测定酶活性的变化，以求出待测药物的含量。

非均相免疫分析最常用的分离方法是固相法，这种固相酶免疫测定技术称为“酶联免疫吸附测定法”，英文缩写“ELISA”。

竞争法的测定过程：

首先将抗体直接吸附在有小孔的反应板孔内，然后将待测样品和定量的酶标药物加入孔内并混匀。将反应板置于适宜温度下温育一定时间，待酶标药物与未标记药物的竞争结合反应达到平衡后，洗去未同抗体结合的游离药物，而与抗体结合的酶标药物和未标记药物（固相载体沉淀部分）则保留在孔内。然后将底物加入孔内，结合在抗体上的酶标药物能催化底物，发生水解、氧化或还原等化学反应，从而产生可测信号。测定时以空白试验（孔内不加待测样品）作参比。

酶免疫分析与上节介绍的放射免疫分析相比，具有环境友好，紫外可以直接测定的优点。缺点：信号不直接，而是需要酶底物、辅酶的参与，引起吸收光谱变化才能测定等。

体内药物与毒物分析课程列表：

1.绪论

-1.1体内药物分析相关的基础理论概述

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体内药物与毒物分析课程列表：

1.绪论

2.体内药物分析相关的基础理论概述

3.生物样品的制备和预处理

4.生物样品分析方法的建立与验证

5.色谱及其联用技术

6.免疫分析法

7.前沿分析技术

8.典型药物的体内分析

9.典型毒物的体内分析

10.典型毒品的体内分析

11.禁毒关键技术虚拟仿真实验

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