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毛细管电泳免疫分析

毛细管电泳免疫分析（CEIA）Capillary Electrophoresis Immunoassay 是将毛细管电泳与免疫分析联合使用的一门新技术。该技术利用抗原-抗体复合物与游离抗原和抗体在电泳行为上的差异，将毛细管电泳作为分离、分析手段，具有样品量少、测定速度快、分离效果好等特点，并能解决免疫反应中的“交叉反应”而造成的假阳性问题。

CEIA分离模式.png

理论上CE的模式都可以用于CEIA，如：

·毛细管区带电泳（CZE）、

·毛细管等电聚焦（CIEF）、

·毛细管凝胶电泳（CGE）、

·胶束电动毛细管电泳( MECC)、

·亲和电泳( ACE)

毛细管区带电泳是最常用，最简单的分离模式。带电粒子质荷比的差异是决定CZE分离的主要因素。抗原抗体形成复合物，引起质荷比改变从而达到分离目的。

胶束电动毛细管电泳是唯一既能分离中性物质，又能分离带电组分的毛细管电泳，适合小分子药物的免疫分析。

毛细管等电聚焦是根据等电点的差异分离多肽或蛋白的毛细管电泳技术。它在分离样品的同时对样品进行浓缩，从而提高检测灵敏度。

CEIA影响因素.png

·电压

·pH值

·离子强度

·温度

·温孵时间

·解离常数等

免疫分析试剂.png

免疫分析试剂主要包括示踪物和特异性抗体。

毛细管电泳免疫分析常用激光诱导荧光检测（LIF）技术检测，标记物是荧光染料。

常用的荧光染料有荧光素类、罗丹明类、藻红素类。

制备均一的示踪物是毛细管电泳免疫分析的关键，因为不均一的示踪物在CE分离时出现多个峰，影响定量。

荧光基团一般与特定基团反应（如伯氨基），对于小分子的半抗原，通常只含有一个荧光染料结合位点，易得到均一的标记物。

对于大分子抗原或抗体，由于含有多个位点，得到的产物往往不均一。因此大分子抗原在使用前需经过纯化，或者用抗原决定簇替代（结构小，结合位点少）。

CEIA对抗体的均一性要求也很高。抗体属于糖蛋白，结构中含有一定数量的唾液酸，其数目变化是导致抗体不均一性的主要原因。通常使用抗体经酶解产生的Fab或Fab’片段作为选择性试剂。

毛细管电泳免疫分析方法.png

方法特点.png

1）需要的样品量少，试剂消耗少（纳升样品和微升级缓冲液）

2）CE分离可在几分钟内完成，提高分析速度且易于自动化

3）可同时测定多种待测物

4）可直接看到免疫复合物的游离和结合形式

5）可使用的检测手段多（LIF、UV、MS）

6）免疫反应在均相中进行，不会因基质的干扰影响分析速度

7）CE分离效率高，可解决免疫分析中交叉反应问题

8）预处理过程简单甚至不需要预处理

9）可在线定量、微量分析、仪器自动化

原理.png

与常规免疫分析相似,毛细管电泳免疫分析也可分为竞争方式和非竞争方式。

·竞争免疫分析的机理：

标记试剂( Ag* 或Ab* )与分析物( Ag 或Ab)同有限试剂竞争反应，如下方程:

Ab(limited)+ Ag* + Ag—— [Ab-Ag]* + [Ab-Ag]+ Ag* + Ag

复合物[ Ab-Ag ]*与游离抗原Ag*在毛细管中得以分离，并得到检测。如果分析物中的Ag越多，Ag*与Ab形成的复合物越少，游离Ag*越多，故通过[Ag* -Ab]和[Ag*]两峰信号比可知Ag的含量。

竞争模式是目前毛细管免疫分析的主要方式，引入标记探针分子，不仅达到了更加灵敏的分析结果，同时也扩大了待测物的范围。由于反应物不需分离，因此，CEIA克服了常规分析中检测相与过量的标记试剂的分离问题。

·非竞争免疫分析的机理：

毛细管电泳免疫的非竞争模式(或直接免疫模式)是以荧光或酶标的抗体或抗体片断( Ab* )与样品中抗原( Ag )反应，标记Ab* 大大过量。反应方程如下:

Ab* + Ag—— Ab* + [ Ab* -Ag ]

CE-LIF可检测到[ Ag* -Ag ]与过量的[ Ab* ]的信号。由于Ab* 浓度过高，因此游离Ab*信号不能充分体现动力范围,而应利用复合物的信号作定量分析的根据。

竞争性与非竞争性ceia的比较.png

检测方法.png

紫外检测.png

早期的CEIA使用紫外吸收检测。

其主要缺点是：检测灵敏度低（最低检测浓度一般为10-6 mol/L）.

使用浓缩技术和间接反应。

激光诱导荧光检测.png

可以检测浓度为10-11~10-12 mol/L的荧光标记物。

存在问题：低浓度样品直接荧光衍生化，复杂样品基质非定量衍生化，多于的标记试剂干扰检测。

使用荧光偏振检测，能提高灵敏度，较少干扰。

粒子计数.png

将抗原附着到抗体涂渍的粒子上，当迁移到检测窗口激光束使粒子产生散射光，通过散射光的强度计数，没被抗原附着的粒子在电泳中不迁移。

检测线可达10-21 mol/L。

体内药物与毒物分析课程列表：

1.绪论

-1.1体内药物分析相关的基础理论概述

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体内药物与毒物分析课程列表：

1.绪论

2.体内药物分析相关的基础理论概述

3.生物样品的制备和预处理

4.生物样品分析方法的建立与验证

5.色谱及其联用技术

6.免疫分析法

7.前沿分析技术

8.典型药物的体内分析

9.典型毒物的体内分析

10.典型毒品的体内分析

11.禁毒关键技术虚拟仿真实验

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