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生物技术药物的体内分析

概述.png

生物技术药物（Biopharmaceutics）利用生物体、生物组织或组成生物体的各种成分综合运用多学科原理与方法制得用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品。

生物技术药物的分类.png

(1)重组蛋白质药物或重组多肽药物包括：细胞因子类，激素类，酶类，疫苗，单抗。

(2)重组DNA药物：反义寡核苷酸或核酸等、基因药物、DNA疫苗等。

(3)干细胞：这是生物技术药物富有发展前景的重要领域。

FDA和CFDA批准的部分生物技术药物.png

FDA和CFDA批准的部分生物技术药物2.png

FDA和CFDA批准的部分生物技术药物3.png

生物技术药物的性质.png

生物技术药物的性质 2.png

体内分析方法.png

生物检定法、免疫学方法、放射性同位素示踪法、LC-MS技术。

免疫分析法：以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法基于竞争抑制原理，标记抗原-抗体的结合率随着未标记抗原量（待测物）的增加而减少。

按照标记物的种类：放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析、荧光免疫分析。

示例.png

C肽与胰岛素双标记时间分辨荧光免疫分析法的建立及初步临床应用。

目前临床诊断筛查中，血清C肽和胰岛素水平对糖尿病的分型诊断、治疗方案选择和疗效监测具有重要的临床参考意义，是筛查诊断糖尿病患者主要的常规必检项目，此外，对于胰岛素瘤的诊断亦有重要参考价值。

在体内，C肽(C肽)与胰岛素(胰岛素)均来自于胰岛β细胞的分泌产物胰岛素原，二者以等分子数共存于分泌颗粒，并同时释放至毛细血管循环中，且C肽不被肝脏破坏，半寿期较胰岛素明显为长，故联合二者检测，能准确测定血循环中C肽水平，能反映β细胞合成与释放胰岛素功能。

时间分辨荧光免疫分析法.png

时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved FIA，TRFIA）用镧系元素的螯合物作为标记物标记抗原或抗体，用时间分辨来测量样品含量的新型荧光免疫分析法。

与传统酶标记、同位素标记等技术相比，TRFIA检测优点：

·灵敏度高（可达mol/L），特别适合体内药物分析

·特异性强（不受样品自然荧光干扰）

·标准曲线范围宽

·无放射性污染

·操作简便

·示踪物稳定

·镧系离子特征性发射光谱窄，且彼此在波长和衰减时间方面差异显著，适合多通道检测

TRFIA是免疫分析技术中公认的最有潜力的含量测定方法。

该研究利用双抗体夹心一步法建立C肽 /胰岛素-TRFIA，具体操作如图所示：

2时间分辨荧光免疫分析法.png

捕获抗体包被：将C肽与insulin mAb包被液混匀，包被96孔板，孵育、洗涤，分泌液封闭；

抗原：25μl待测血或不同浓度的C肽/insulin混合标准品检测抗体；

孵育：200μl Sm-C肽/Eu3-insulin mAb混合液；

全自动TRFIA检测器。

方法学验证.png

·线性范围

C肽和胰岛素标准曲线的相关系数分别为0.9998和0.9996，表明线性相关性良好。

线性范围1.png

线性范围2.png

·灵敏度：

C肽的最低检测下限为0.25μg/L；胰岛素的最低检测下限为0.1mU/L。此灵敏度与PE公司相应的单标记试剂灵敏度基本相同。

·精密度实验：

C肽和胰岛素分析内和分析间变异系数均在10%以内。

·回收率：

在已知5个不同浓度的C肽和胰岛素血清中加入不同浓度的C肽和胰岛素纯抗原，使得血清中C肽和胰岛素的最终期望浓度分别为20μg/L和100mU/L，计算回收率，C肽与胰岛素的回收率均在99.0% ～102% 之间，表明添加物与血清被测物一致，基本没有血清基质物的干扰。

·特异性：

采用双标记C肽/胰岛素-TRFIA检测，CEA、hTSH、BSA等系列浓度标准品做交叉反应检测，结果均无交叉反应。

该研究采用稀土离子Eu3+ 和Sm3+ 为标记物，研究建立了C-peptide 与insulin 的双标记TRFIA，一次检测可同时确定血清中C-peptide 和insulin 含量，且准确、特异、快速，低廉，适合大规模筛查中应用。

高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术.png

根据不同的研究目的，葡萄糖钳夹技术分为高糖钳、正糖钳及低糖钳等不同方法。

·原理：正糖钳技术通过同时输注可控浓度及速率的外源性胰岛素和葡萄糖，打破体内葡萄糖—胰岛素的负反馈调控，使血浆外源性胰岛素维持在较高浓度水平，而血糖维持在基础稳态水平。

由于血浆外源性胰岛素的优势浓度，抑制了内源性葡萄糖(肝糖分解和糖异生)和内源性胰岛素分泌，此时外源性葡萄糖输注速率等于外周组织的葡萄糖利用率，从而评价葡萄糖、胰岛素以及其他相关物质的代谢过程。

·特点：

（1）该技术避免了内源性胰岛素缺乏(如糖尿病患者)及低血糖(如胰岛素耐量试验中)对胰岛素敏感性测定的影响。

（2）将内源性干扰减至最小，增加了实验的可控性与准确性，降低了结果的变异性。已成为评估胰岛素敏感性的金标准。

·不足：

（1）不同受试者的应激反应和血管紧张度等诸多因素会对稳态的建立产生一定的影响。

（2）该技术复杂耗时、费用昂贵，实验中需频繁取血一定程度上限制了其大规模临床应用。

·实验方法：

（1）建立静脉输液通道及采血通道在前臂静脉或正中静脉穿刺并留置导管建立输液通道，用于输入胰岛素和葡萄糖溶液。葡萄糖和胰岛素输注通道经三通管与静脉通道联接。采血通道由输液器、三通管、带延长的三通管、静脉留置针依次串连在一起，2个三通管的侧孔分别接上注射器，并保持管道通畅。

（2）钳夹实验测定受试者基础血糖值，设为钳夹目标。用加热型护手袋包裹采血的手臂，使静脉血动脉化。钳夹实验开始，前10min内给予受试者1个胰岛素负荷剂量，快速升高血浆胰岛素水平以抑制体内肝糖输出和内源性胰岛素的分泌。然后以某一固定速率持续输注，获得一个稳定的高浓度血浆胰岛素水平。

在此期间,每隔5min测定1次血糖值，根据DeFronzo经验公式调节葡萄糖输注率，维持血糖于目标水平，血糖趋于稳定状态时即钳夹形成。

（3）正糖钳技术指标

①钳夹稳态下血糖(SSPG)：

需控制在正常空腹血糖±10%范围内。血糖稳定表明内源性胰岛素及葡萄糖被抑制，是钳夹建立成功与否最直观的评判指标。

②钳夹稳定状态下胰岛素(SSINS)：较高的血浆外源性胰岛素水平才能抑制内源性肝糖及胰岛素的生成，满足实验要求。

③血糖变异系数(CVBG)：钳夹实验期间CVBG可反映钳夹技术的稳定性与准确性。

④稳态葡萄糖输注速率(SSGIR):SSGIR等于外周组织的葡萄糖利用率，可用来评价外周组织(主要是肌肉组织)胰岛素作用，反映机体组织的胰岛素敏感性。

⑤内源性胰岛素分泌：C肽水平可评估内源性胰岛素分泌，粗略判断内源性胰岛素分泌的抑制程度。

体内药物与毒物分析课程列表：

1.绪论

-1.1体内药物分析相关的基础理论概述

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体内药物与毒物分析课程列表：

1.绪论

2.体内药物分析相关的基础理论概述

3.生物样品的制备和预处理

4.生物样品分析方法的建立与验证

5.色谱及其联用技术

6.免疫分析法

7.前沿分析技术

8.典型药物的体内分析

9.典型毒物的体内分析

10.典型毒品的体内分析

11.禁毒关键技术虚拟仿真实验

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