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分析方法验证的内容与要求（一）

特异性.png

方法的特异性(specificity)，又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用，用以证明使用该方法所测定的物质是预期的待测物，生物样品所含内源性物质和相应代谢物、降解产物及其共同使用的药物不得干扰对样品的测定。

验证一个分析方法特异性应考虑：

内源性物质的干扰.png

比较待测物的标准物质、至少6个受试者的空白生物介质、质控（QC）样品的检测信号。

当干扰组分的响应低于分析物定量下限（LLOQ）响应的20%，并低于内标响应的5%时，通常即可以接受。

代谢物的干扰.png

比较QC样品和至少6个不同个体用药后的实际生物样品的检测信号。

在适当情况下，应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母体分析物的可能性。

合并药物的干扰.png

临床治疗药物监测时，还要考虑患者可能同时服用其他药物的干扰。

与参比方法的相关性.png

参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法。

标准曲线与定量范围.png

标准曲线（standard curve），亦称校正曲线（calibration curve）或工作曲线（working curve），反映了生物样品中分析物的浓度与仪器响应值的关系。

除免疫分析等少数方法外，标准曲线通常为线性模式。

定量范围.png

标准曲线的建立.png

标准曲线图文.png

配制校正标样时，当标准溶液加入体积较大且其中含有高浓度的有机溶剂时，可能造成部分生物基质变性，使校正标样与实际生物样品不一致，进而造成分析结果的偏差。此时，可先加入标准溶液，挥干溶剂后，再加入空白生物基质溶解混匀。

线性模式的标准曲线至少应包含6个浓度点（不包括零点，即空白样品）。

非线性模式的浓度点应适当增加。

标准曲线的定量范围应尽量覆盖预期浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知生物样品的浓度。

标准曲线的绘制.png

取系列校正标样，按拟定的分析方法处理，以待测药物的检测响应（如色谱峰面积）或与内标物质（内标法）的响应的比值为因变量（y），以标样中的药物浓度为自变量（x），进行线性回归分析，求得回归方程（y=a+bx）及其相关系数（γ），并绘制标准曲线。

校正标样中的分析物浓度，以单位体积或质量的生物介质中加入标准物质的量表示，如μg/ml或μg/g等。

最常用的回归分析法为最小二乘法，但当线性范围较宽的时候，推荐采用加权最小二乘法对标准曲线进行计算，以使低浓度点计算得比较准确。

标准曲线各浓度点依据回归方程回算的浓度与标示值之间的偏差在可接受的范围之内时，可判定标准曲线合格。

可接受范围一般规定为：

（1）最低浓度点的偏差在±20%以内；其余浓度点的偏差在±15%以内。

（2）至少75%校正标样，含最少6个有效浓度，应满足上述标准。

（3）如果某个校正标样结果不符合这些标准，应该拒绝这一标样，不含这一标样的标准曲线应被重新评价。

（4）回归方程的截距应接近于零，若显著偏离零点，应确证对方法的准确度无影响；

（5）相关系数应接近于1，即具有良好的相关性，通常要求r≥0.99（色谱法）或0.98（生物学法）。

定量下限（LLOQ）.png

定量下限是标准曲线的最低点，表示方法的灵敏度，是能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度。

在药代动力学与生物利用度研究中，LLOQ应能满足3~5个消除半衰期时体内样品中的药物浓度或Cmax的1/20～1/10的药物浓度的测定。

测定时取同一生物基质，制备至少5个独立的质控样品。

信噪比.png

提高方法的灵敏度的措施：

（1）提高仪器本身的检测灵敏度；

（2）提高进样体积；

（3）提高样品的浓缩程度或降低样品稀释度；

（4）改进预处理方法和色谱条件，消除干扰，降低空白值；

（5）选择合适的检测器。

精密度与准确度.png

精密度.png

在确定的分析条件下，相同生物介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度，表示该分析方法的可重复性。

通常用QC样品的相对标准差（RSD）表示。

体内药物分析中，通常在1个工作日内难以完成全部的生物样品分析，在不同工作日之间的试验条件有可能发生微小的改变，进而影响分析结果。

因此，除考察批内（within-run或intra-batch）精密度外，还应考察批间（between-run或inter-batch）精密度。

准确度.png

在确定的分析条件下，测得的体内样品浓度与真实浓度的接近程度。

通常用QC样品的实测浓度与标示浓度的相对回收率（relative recovery，RR）或相对偏差（relative error，RE）表示。

公式.png

测定法.png

批内准确度和精密度：取一个分析批的定量下限及低、中、高浓度质控样品进行考察，每个浓度至少用5个样品，同时进行准确度和精密度考察。

低浓度质控样品选择在定量下限浓度的3倍以内，中浓度质控样品选择标准曲线范围中部附近，高浓度质控样品选择标准曲线范围上限约75%处。

批量准确度和精密度.png

在QC样品测定的同时做随行标准曲线，将每批QC样品的响应值代入随行标准曲线的回归方程，求得QC样品浓度。

限度要求

准确度（RR）：LLOQ附近，80%~120%；一般应在85%~115%范围内。

精密度（RSD）：LLOQ附近，不超过 20%；一般不超过15%。

体内药物与毒物分析课程列表：

1.绪论

-1.1体内药物分析相关的基础理论概述

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体内药物与毒物分析课程列表：

1.绪论

2.体内药物分析相关的基础理论概述

3.生物样品的制备和预处理

4.生物样品分析方法的建立与验证

5.色谱及其联用技术

6.免疫分析法

7.前沿分析技术

8.典型药物的体内分析

9.典型毒物的体内分析

10.典型毒品的体内分析

11.禁毒关键技术虚拟仿真实验

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