当前课程知识点：植物组织培养技术 > 2.植物组织培养的基本设备与基本技术 > 2.11. 无菌操作 > 2.11.无菌操作
大家好
植物组织培养中培养的外植体材料
培养基是无菌的
组织培养过程中许多操作需要在无菌条件下进行
就要求对环境培养基器械等进行灭菌
操作过程也是要求无菌操作
无菌操作需要从以下几个环节着手
第一个环节接种室的灭菌
植物组织培养的接种室也称无菌操作室
是进行植物材料的灭菌接种以及培养物的继代转移操作的场所
接种室要定期消毒
方法是用甲醛和高锰酸钾产生的蒸气熏蒸
室内安装紫外光灯
在接种前开启紫外灯20min左右
进行灭菌。室内还应保持无尘、清洁状态
进入接种室前应在缓冲室或更衣室内
更换工作服鞋和帽
避免把杂菌带入室内
第二个环节 器皿器械灭菌
干热灭菌干热灭菌是将器械
用具长时间放在高温下消除杂菌的一种方法
其具体做法是将需要灭菌的器具如玻璃器皿金属器械
先用铝箔包好放入温度为170℃的恒温干燥箱内
保温2h冷却后取出便可以使用
高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌是将需灭菌的玻璃器皿培养基等放入高压蒸汽灭菌锅内
通过高温高压进行灭菌的一种方法
在无菌操作中使用的无菌水
无菌滤纸也需要通过高压湿热灭菌来制备
具体方法是把蒸馏水盛入三角瓶中
装入量不超过2/3，封口
无菌滤纸是取数张滤纸装入大小适宜的培养皿中
用牛皮纸或羊皮纸包裹装入高压灭菌锅内进行灭菌
灼烧灭菌
接种器械如解剖刀镊子等一般用火焰灼烧的方法灭菌
即把金属器械放入95%的工业酒精中浸蘸一下
然后在酒精灯外焰上灼烧灭菌
使用这种方法时一定要使酒精瓶与酒精灯保持一定的距离
以防止酒精瓶中酒精被点燃而发生事故
现多采用电热接种器械灭菌器进行接种工具灭菌
温度可调节至摄氏280-300度
在使用的过程中只需要把器械插入灭菌器中约15s即可
方便而且安全
第三个环节 外植体灭菌
1.外植体灭菌一般方法
在植物组织培养中获得无菌外植体是组织培养成功的必要前提
取自于大田或温室的材料常带有大量的细菌和真菌
因此通过化学药剂消除植物材料上的杂菌是植物组织培养的一个非常重要的环节
2.常用的灭菌药剂
对灭菌药剂的要求是灭菌效果好从植物组织上容易清除
对人体无害不污染环境
在常用的灭菌剂中70%～75％的酒精是最常见的表面灭菌剂
酒精具有较强的穿透力和灭菌作用
对植物材料的杀伤作用也很大
在进行植物材料灭菌时
可将材料在70％酒精中浸泡10～30s进行表面灭菌
然后再将植物材料放到其它灭菌剂中进行彻底灭菌
如果在酒精中浸泡时间过长植物材料的生长将会受到影响
甚至被酒精杀死
次氯酸钠是一种较好的灭菌剂
它可以释放出活性氯离子从而杀死细菌真菌
次氯酸钠在作为植物材料的灭菌剂时常用浓度是有效氯浓度为2%
浸泡时间为5～30min
灭菌时间的长短可根据植物材料情况而定
灭菌时注意观察材料情况
次氯酸钠的灭菌力很强不易残留对环境无害
但次氯酸钠溶液碱性很强
对植物材料也有一定的损害作用因此次氯酸钠的处理时间不宜过长
氯化汞又称升汞灭菌原理是汞离子可以与带负电荷的蛋白质结合
使蛋白质变性从而杀死菌体
常用浓度为0.1%～0.2%浸泡时间为2～15min
氯化汞的灭菌效果极佳其缺点是易在植物材料上残留
灭菌后应多次冲洗至少冲洗5次
而且氯化汞对环境危害大对人畜的毒性极强
应尽量避免使用使用后做好回收工作
3.植物材料灭菌的一般过程
第一步 材料前处理
从田间或温室取回的材料
用自来水冲洗20min左右洗去泥土等污垢
剪去残伤部分再用自来水冲洗30分钟
然后剪成小段放入烧杯中
第二步 材料灭菌
在超净工作台上把经过前处理的材料放入75％酒精中
进行表面消毒约10秒钟取出后
立即放入有效氯浓度为2%的次氯酸钠溶液或其他灭菌剂中灭菌
数分钟后取出放入无菌水中冲洗3～5次
然后将材料放到无菌培养皿中用无菌滤纸吸干水分
准备接种操作中所用的镊子解剖刀
培养皿和培养皿中的滤纸均是无菌的
镊子等器具在使用过程中还要随时用酒精灯灼烧的方法灭菌
或 插入电热灭菌器中灭菌
用无菌冷却的镊子将经灭菌处理的材料
放置在无菌滤纸上 吸干水分然后一手拿解剖刀一手拿镊子
根据需要进行适当的切割
一定要把在灭菌中受到灭菌液伤害的部位切除掉
用无菌镊子将切割好的外植体插植到培养基表面
用于封口的瓶盖或薄膜则应注意放置在灭过菌的表面上
瓶盖或薄膜的里面不可接触任何物体
接种时注意解剖刀和镊子每切完1个材料或接完1瓶材料
插入电热灭菌器中灭菌片刻放凉备用
常3把镊子交换使用
可提高工作效率并可防止交叉污染的发生
那么什么是交叉污染如镊子夹了没有灭菌好的材料再夹其它材料
造成的污染就是交叉污染解剖刀镊子碰到台面瓶的外壁
封口纸膜以及手拿的部位过近未能充分灼烧
或连续使用过久都易引起交叉污染经常灼烧接种工具便可防止交叉污染
即便有污染也是独立发生的
不会造成连续成片地污染每切完一个材料
应更换一张无菌滤纸用无菌滤纸吸干材料水分
也有防止交叉污染的作用
总之要仔细理解并牢固建立“ 无菌”的概念
处处严格执行无菌操作的要领
接种好的材料要置于培养间进行培养
一般光照1500~3000Lx每天12~16h光照
温度摄氏23左右
植物组织培养中污染是经常发生的造成污染的原因很多
如外植体带菌培养基及器皿
器械灭菌不彻底工作人员操作不规范等都会造成污染
污染来源主要为细菌和真菌两大类
细菌污染的特点是菌落在接种1～3d即可发现
呈粘液状
而真菌污染的特点是污染部分长有不同颜色的霉菌
在接种3天甚至半个月后才出现
-1.1. 植物组织培养的概念和理论基础
-1.1. 植物组织培养的概念和理论基础--作业
-1.2. 植物组织培养的类型
-1.2. 植物组织培养的类型--作业
-1.3.植物组织培养的发展简史
-1.3.植物组织培养的发展简史--作业
-1.4. 植物组织培养的应用
-1.4. 植物组织培养的应用--作业
-2.1. 植物组织培养实验室布局
-2.1. 植物组织培养实验室布局--作业
-2.2. 植物组织培养实验室的基本设备
-2.2. 植物组织培养实验室的基本设备--作业
-2.3. 植物组织培养常用仪器
-2.3. 植物组织培养常用仪器--作业
-2.4. 植物组织培养常用器皿
-2.4. 植物组织培养常用器皿--作业
-2.5. 培养基的基本成分及其作用
-2.5. 培养基的基本成分及其作用--作业
-2.6. 培养基的种类
-2.6. 培养基的种类--作业
-2.7. 培养基母液的配制与保存
-2.7. 培养基母液的配制与保存--作业
-2.8. 操作演示1: 培养基母液的配制
--培养基母液的配制
-2.植物组织培养的基本设备与基本技术--2.8. 操作演示1: 培养基母液的配制
-2.9. 培养基的配制与灭菌
-2.9. 培养基的配制与灭菌--作业
-2.10. 操作演示2: 培养基配制及高压灭菌
-2.植物组织培养的基本设备与基本技术--2.10. 操作演示2: 培养基配制及高压灭菌
-2.11. 无菌操作
-2.11. 无菌操作--作业
-3.1. 外植体的选择
-3.1. 外植体的选择--作业
-3.2. 初代培养
--3.2.初代培养
-3.2. 初代培养--作业
-3.3. 操作演示3: 外植体灭菌技术及初代培养
-3.3. 操作演示3: 外植体灭菌技术及初代培养--作业
-3.4. 继代培养
-3.4. 继代培养--作业
-3.5. 操作演示4: 继代培养操作
-3.5. 操作演示4: 继代培养操作--作业
-3.6. 试管苗生根
-3.6. 试管苗生根--作业
-3.7. 试管苗驯化与移栽
-3.7. 试管苗驯化与移栽--作业
-3.8. 操作演示5: 试管苗驯化移栽
-3.8. 操作演示5: 试管苗驯化移栽--作业
-3.9 提高试管苗移栽成活率的途径
-3.9 提高试管苗移栽成活率的途径--作业
-3.10. 影响快繁因素的调控
-3.10. 影响快繁因素的调控--作业
-3.11. 污染
--3.11.污染
-3.11. 污染--作业
-3.12. 褐变
--3.12.褐变
-3.12. 褐变--作业
-3.13. 玻璃化
--3.13.玻璃化
-3.13. 玻璃化--作业
-3.14. 体细胞无性系变异
-3.14. 体细胞无性系变异--作业
-3.15. 快繁试验方案的设计与实施
--3.15.植物组织培养快繁试验方案的设计与实施 .pdf
-3.15. 快繁试验方案的设计与实施--作业
-4.1. 脱毒苗培育的意义
-4.1. 脱毒苗培育的意义--作业
-4.2. 脱毒的主要方法
-4.2. 脱毒的主要方法--作业
-4.3. 脱毒的其他方法
-4.3. 脱毒的其他方法--作业
-4.4. 脱毒苗的鉴定
-4.4. 脱毒苗的鉴定--作业
-4.5. 脱毒苗的保存与繁殖
-4.5. 脱毒苗的保存与繁殖--作业
-4.6. 甘薯脱毒步骤
-4.6. 甘薯脱毒步骤--作业
-4.7. 甘薯脱毒苗的繁育体系
-4.7. 甘薯脱毒苗的繁育体系--作业
-5.1.人工种子
--5.1.人工种子
--人工种子.pdf
-5.1.人工种子--作业
-5.2.试管微茎
--5.2.试管微茎
--试管微茎.pdf
-5.2.试管微茎--作业
-5.3.无糖培养技术
-5.3.无糖培养技术--作业
-考试题1
-参考文献
