当前课程知识点:植物组织培养技术 > 3. 植物组织培养快繁技术 > 3.3. 操作演示3: 外植体灭菌技术及初代培养 > 3.3.操作演示3.外植体灭菌技术及初代培养
大家好
外植体灭菌
是植物组织培养技术中
至关重要的无菌操作技术
目的是获得无菌且活的外植体
我们以非洲紫罗兰叶片灭菌为例
演示无菌操作过程
非洲紫罗兰又名非洲堇
多年生草本植物
原产东非的热带地区
植株小巧玲玫
花色斑斓
四季开花
是室内的优良花卉
也是国际上著名的盆栽花卉
被誉为室内花卉皇后
在欧美地区栽培特别盛行
第一步选取外植体
剪取无病虫害的嫩叶
置于烧杯中用自来水冲洗
冲洗时间约3分钟
目的是冲掉叶片上的灰尘和细菌孢子等
第二步超净工作台紫外灭菌
将酒精灯
手术刀 镊子
电热灭菌器 无菌纸等
置于超净工作台台板上
打开超净工作台电源开关
调节风速并打开紫外灯
进行超净工作台表面灭菌
灭菌时间为20分钟
然后关闭紫外灯
保持黑暗10分钟后再打开照明开关
以防止一些细菌的光复活
第三步
接种器械灭菌
打开电热灭菌器电源开关
设置温度为290℃左右
用蘸有75%酒精棉球
擦拭双手 台面
用酒精棉球
擦拭手术刀镊子等工具
并插入电热灭菌器中
将接种工具冷却支架
用火焰灼烧的方法进行灭菌
将要使用的各种溶液
洗好的植物材料 无菌水
培养基用酒精棉球擦拭后
置于超净工作台上
第四步外植体灭菌
将灭菌器中的镊子
手术刀取出置于支架上冷却
用冷却的镊子将材料放入
75%酒精消毒10秒钟
再用有效率浓度为2%次氯酸钠溶液
灭菌20~25min
灭菌期间要盖上灭菌瓶盖
在此过程中 每隔数分钟 晃动一次
以赶走黏附在植物材料上的气泡
最后倒掉NaClO溶液再用无菌水冲洗3~4次
第五步无菌接种
将已灭菌的材料
置于无菌培养皿中的无菌滤纸上
吸干材料上的水分
用镊子固定材料
用解剖刀将嫩叶切成长宽约5mm左右的小块
用无菌镊子
将外植体接入培养瓶内
材料的放置应注意极性
一般是形态学上端向上形态学下端向下
接种时注意不要使镊子接触到瓶口并立即封口
第六步离体材料培养
接种后的外植体放置于培养间
于25摄氏度
光照强度为2000到3000勒克斯
14小时光照10小时黑暗的条件下培养
第七步培养材料的观察
培养材料放置于培养室中培养
要定期的观察
一是检查培养材料是否有污染
二是观察培养材料的形态是否发生变化
如果灭菌不彻底
材料上有细菌或真菌孢子
一般接种后1~2天就能发现细菌污染
3~10天就能发现真菌污染
细菌性污染的症状与真菌性污染症状不同
细菌性污染是菌落呈黏液状
颜色多为白色
与培养基表面界限清楚
真菌性污染的症状
真菌性污染的症状是菌落多为黑色绿色
白色的绒毛状棉絮状
与培养基和培养物的界限不清
认清污染物类型有助于我们分析造成污染的原因
降低以后的试验中污染率
不管是何种污染都要及时从培养室中取出以防污染物扩散
污染的材料高压灭菌后再清洗
观察培养材料可以看到材料的脱分化过程和再分化过程
有助于我们对培养基成分是否合适的再进行研判
下面我们通过两张图片来观察一下
非洲紫罗兰叶片脱分化与再分化的形态变化
-1.1. 植物组织培养的概念和理论基础
-1.1. 植物组织培养的概念和理论基础--作业
-1.2. 植物组织培养的类型
-1.2. 植物组织培养的类型--作业
-1.3.植物组织培养的发展简史
-1.3.植物组织培养的发展简史--作业
-1.4. 植物组织培养的应用
-1.4. 植物组织培养的应用--作业
-2.1. 植物组织培养实验室布局
-2.1. 植物组织培养实验室布局--作业
-2.2. 植物组织培养实验室的基本设备
-2.2. 植物组织培养实验室的基本设备--作业
-2.3. 植物组织培养常用仪器
-2.3. 植物组织培养常用仪器--作业
-2.4. 植物组织培养常用器皿
-2.4. 植物组织培养常用器皿--作业
-2.5. 培养基的基本成分及其作用
-2.5. 培养基的基本成分及其作用--作业
-2.6. 培养基的种类
-2.6. 培养基的种类--作业
-2.7. 培养基母液的配制与保存
-2.7. 培养基母液的配制与保存--作业
-2.8. 操作演示1: 培养基母液的配制
--培养基母液的配制
-2.植物组织培养的基本设备与基本技术--2.8. 操作演示1: 培养基母液的配制
-2.9. 培养基的配制与灭菌
-2.9. 培养基的配制与灭菌--作业
-2.10. 操作演示2: 培养基配制及高压灭菌
-2.植物组织培养的基本设备与基本技术--2.10. 操作演示2: 培养基配制及高压灭菌
-2.11. 无菌操作
-2.11. 无菌操作--作业
-3.1. 外植体的选择
-3.1. 外植体的选择--作业
-3.2. 初代培养
--3.2.初代培养
-3.2. 初代培养--作业
-3.3. 操作演示3: 外植体灭菌技术及初代培养
-3.3. 操作演示3: 外植体灭菌技术及初代培养--作业
-3.4. 继代培养
-3.4. 继代培养--作业
-3.5. 操作演示4: 继代培养操作
-3.5. 操作演示4: 继代培养操作--作业
-3.6. 试管苗生根
-3.6. 试管苗生根--作业
-3.7. 试管苗驯化与移栽
-3.7. 试管苗驯化与移栽--作业
-3.8. 操作演示5: 试管苗驯化移栽
-3.8. 操作演示5: 试管苗驯化移栽--作业
-3.9 提高试管苗移栽成活率的途径
-3.9 提高试管苗移栽成活率的途径--作业
-3.10. 影响快繁因素的调控
-3.10. 影响快繁因素的调控--作业
-3.11. 污染
--3.11.污染
-3.11. 污染--作业
-3.12. 褐变
--3.12.褐变
-3.12. 褐变--作业
-3.13. 玻璃化
--3.13.玻璃化
-3.13. 玻璃化--作业
-3.14. 体细胞无性系变异
-3.14. 体细胞无性系变异--作业
-3.15. 快繁试验方案的设计与实施
--3.15.植物组织培养快繁试验方案的设计与实施 .pdf
-3.15. 快繁试验方案的设计与实施--作业
-4.1. 脱毒苗培育的意义
-4.1. 脱毒苗培育的意义--作业
-4.2. 脱毒的主要方法
-4.2. 脱毒的主要方法--作业
-4.3. 脱毒的其他方法
-4.3. 脱毒的其他方法--作业
-4.4. 脱毒苗的鉴定
-4.4. 脱毒苗的鉴定--作业
-4.5. 脱毒苗的保存与繁殖
-4.5. 脱毒苗的保存与繁殖--作业
-4.6. 甘薯脱毒步骤
-4.6. 甘薯脱毒步骤--作业
-4.7. 甘薯脱毒苗的繁育体系
-4.7. 甘薯脱毒苗的繁育体系--作业
-5.1.人工种子
--5.1.人工种子
--人工种子.pdf
-5.1.人工种子--作业
-5.2.试管微茎
--5.2.试管微茎
--试管微茎.pdf
-5.2.试管微茎--作业
-5.3.无糖培养技术
-5.3.无糖培养技术--作业
-考试题1
-参考文献