8.2 电泳技术、PCR和DNA测序慕课视频播放-现代生物学导论-MOOC慕课视频教程-柠檬大学

DNA结构的发现，为更多的DNA技术打开了大门

这些DNA技术的核心就是核酸杂交

即一条核苷酸链和另外一条互补的核苷酸链进行碱基配对

在这一节中，我们先介绍PCR技术

然后探讨其他用于重组DNA的DNA技术：DNA测序和电泳

前面在介绍重组DNA技术时，我们知道得到目的基因是首要的任务

很多时候，我们通过体外扩增的方式得到目的基因

再使用限制性内切酶剪切

PCR就是一项非常有效率的体外扩增的技术

PCR，全称是Polymerase Chain Reaction，即聚合酶链式反应

这项技术是由美国生化学家Kary Mullis在1983年发明的

他因此获得了1993年诺贝尔化学奖

PCR这项技术可以对特定的DNA区域，比如目的基因进行大规模扩增

它的扩增原理其实和我们平时看到的大师傅拉面的原理很相似

我在这里做一个展示：首先是一段比较粗的面

然后我们进行第一次对折，2的1次方，产生2段面条

然后进行第二次对折，2的2次方，产生4段面条

第三次对折，23，产生8段面条…

以此类推，所以我进行了N次对折，最后就会产生2的N次方段的面条

PCR也是同样的，经过N次循环后，会产生2N拷贝

也就是说，每次循环，特定的DNA区域就会被复制一次

那么在每次循环中，DNA是怎么被复制的

我们前面学习过DNA复制开始需要打开双链

这个过程是由解旋酶完成的，那么在PCR中我们是否也需要这种酶呢

答案是不需要的，我们可以通过高温加热的方式使DNA变性

即联系两条双链的氢键断裂，导致双链的分开

这是每个循环中的第一步，叫做变性

因为我们要扩增特定区域内的DNA片段，还有需要一段引物和模板结合

这样DNA聚合酶才能够从3'端添加核苷酸

所以我们需要人工设计并添加引物

就像图中展示的一样，有一个5'到3‘的还有一个3’到5‘的引物，确定扩增的区域

这是每个循环中的第二步，叫做退火

然后，DNA聚合酶就可以结合上来进行添加核苷酸，实现新链的合成

这是每个循环中的第三步，叫做延伸

需要注意的是第一步的温度范围一般为94-96℃

第二步为50-65℃，第三步为75-80℃

因为这是一项体外扩增技术

我们在实验开始需要把模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTP等放入试管中

这里有一个问题：我们知道很多酶在高温的情况下会出现失活的现象

那么在PCR中高温情况下我们怎么办呢

事实上PCR反应使用的DNA聚合酶是从一种水生栖热菌中提取出来的

可以耐受高温而不失活，这种DNA聚合酶叫做Taq DNA聚合酶

这样，通过多次PCR循环后得到大量的目的基因的拷贝

我们前面也说过把目的基因连接到载体后，通过转化导入宿主细胞

一般我们在转化之前需要对连接产物进行检测

因为，使用同一种限制性内切酶后，再使用连接酶连接

会出现很多质粒载体自己连接的情况

所以连接反应后会混有目的基因和载体连接物，和载体自行连接物

为了提高重组DNA转化入宿主细胞的效率

我们在转化前需要对连接物进行检验

还是刚才的例子，我们已知载体和目的基因的分子量

比如说5Kb和2Kb，那么对于连接物的分子量我们就知道了，是7Kb

我们可以通过电泳技术进行检测

电泳技术是根据大分子的分子量、形状和电荷差异

用来分离和分析大分子的

原理是使用一种介质，通电后让DNA等大分子在其中进行运动

由于DNA的骨架是磷酸，带负电荷，所以会向阳极移动

这种介质一般是琼脂糖，其溶液在凝固时会形成琼脂糖凝胶

产生网状结构，其中的孔洞在分子运动时会起到阻碍的作用

大分子和小分子在其中的运动规律，我们可以用下面这个比方来解释

比如大象和小老鼠通过一片规定距离的障碍物

大象由于体积较大，在穿过障碍物时遇到的阻力较大，所以运行比较慢

而对于小老鼠而言，体积较小，穿过障碍物时遇到的阻力也比较小

所以运行较快，比大象先走出障碍物

同理：大分子量的DNA在穿过琼脂糖凝胶时运动较慢

而小分子量的DNA运动较快，所以小分子量的DNA最先到达凝胶底部

这是一张典型的电泳结果图

我们看到不同分子量的DNA在凝胶上的位置不同

最下面的也是运行最快的，是分子量最小的

最上面的是分子量大的

所以结合我们刚才质粒上连接目的基因的结果

我们就可以通过电泳检测出哪些是质粒自行连接的产物

哪些是插入目的基因的质粒产物

下面请同学们思考一下：下面三种情况，同样分子量，哪种分子运动最快

（1）双链环状DNA（2）双链断裂的环状DNA（3）有一条链断裂的环状DNA

利用碱基互补配对原则可以知道一段完整的DNA的核苷酸序列

测序技术是确定DNA分子中特定的核苷酸排列顺序

也就是ATCG四种碱基的排列顺序

我们前面学习到，DNA在复制时

DNA聚合酶把新的核苷酸添加到3'OH端

新的核苷酸的5'磷酸和下一个核苷酸的3'OH形成磷酸二酯键

如果我们加入这样一种分子，和DNA中的核苷酸差不多

但是第三位的碳原子上没有氧原子，这种分子叫做双脱氧核苷酸

如果这样的核苷酸被添加到正在复制的DNA链中，由于3'端没有氧原子

就无法和下一个核苷酸形成磷酸二酯键，DNA的合成终止

测序技术就是根据这个原理

比如要合成一段序列为TACGCTAGCAGGTCCA的DNA分子

如果在这个反应体系中加入放射性标记的双脱氧核苷酸T

那么反应体系中可能会出现这样几种情况

反应可以停止在这个位置，也可以停止在这个位置

也可以停止在这里，还有这里

然后，我们把反应结果进行电泳分析

这个电泳可以把一个碱基的差别分离出来，那么电泳结果就会是这样的

我们可以看到被标记的T在凝胶上的几个位置

如果我们用同样的方法分别标记A，C和G

分别加入到三个独立的反应体系中，那么在凝胶上的结果就会是这样的

我们可以看到被标记的四种碱基的排列顺序

我们也就知道了这段DNA的序列

这项测序技术是由英国生化学家Frederick Sanger发明的

他因此获得了1980年的诺贝尔化学奖

现代生物学导论课程列表：

第一讲绪论

-1.1 生物学的基本主题

--1.1 生物学的基本主题

-1.2 科学方法

--1.2 科学方法

-1.3 如何正确地评价科学结果

--1.3 如何正确地评价科学结果

-1.4 施一公老师和不同院系本科生座谈（上）

--1.4 施一公老师和不同院系本科生座谈(上)

-1.5 施一公老师和不同院系本科生座谈（下）

--1.5 施一公老师和不同院系本科生座谈（下）

-第一周的思考题

第二讲生命的化学基础

-课前小短片

-2.1 元素和化学键

-2.2 水和生命

-2.3 碳和生命的分子多样性

-2.4 大生物分子

-2.5 营养以及身体健康

-第二讲小测验--作业

第三讲细胞的基本知识

-课前小短片

-3.1 细胞的结构和功能

-3.2 细胞膜和跨膜运输

-3.3 细胞间交流

-3.4 细胞分裂和细胞周期

-3.5 癌症与细胞分裂

-第三讲小测验--作业

第四讲能量和代谢

-课前小短片

-4.1 热动力学和代谢

-4.2 自由能和代谢

-4.3 ATP的工作原理

-4.4 活化能和酶

-4.5 酶的反应特性和酶的调控

-4.6 细胞呼吸

-4.7 光合作用

-第四讲小测验--作业

第五讲遗传学基本知识

-课前小短片

-5.1 减数分裂和生命周期

-5.2 孟德尔遗传学

-5.3 孟德尔遗传学的延伸

-5.4 基因连锁和染色体互换

-5.5 伴性遗传

-5.6 非孟德尔遗传

-5.7 人类遗传学疾病及诊断

-第五讲小测验--作业

第六讲遗传的分子基础

-课前小短片

-6.1 DNA是遗传物质

-6.2 DNA结构和染色体结构

-6.3 DNA的复制

-6.4 DNA的突变、损伤和修复

-6.5 DNA重组

-第六讲遗传的分子基础--第六讲小测验

第七讲基因的表达和调控

-课前小短片

-7.1 基因表达综述

-7.2 基因表达的具体步骤

-7.3 突变和表型

-7.4 基因表达调控的特点

-7.5 原核生物的基因表达调控

-7.6 真核生物的基因表达调控

-7.7 表观遗传

-第七节小测验--作业

第八讲重组DNA

-课前小短片

--课前小短片

-8.1 重组DNA

--8.1 重组DNA

-8.2 电泳技术、PCR和DNA测序

--8.2 电泳技术、PCR和DNA测序

-8.3 转基因动物、克隆动物和干细胞研究

--8.3 转基因动物、克隆动物和干细胞研究

-8.4 转基因植物

-8.5 DNA技术的应用

-8.6 生物的信息时代

-8.7 新药研发的基本过程

-第八章小测验--作业

第九讲生物演化的介绍

-课前小短片

--课前小短片

-9.1 演化理论的介绍

--9.1 演化理论的介绍

-9.2 演化的证据

--9.2 演化的证据

-9.3 Hardy-Weinberg定律

--9.3 Hardy-Weinberg定律

-9.4 改变种群中等位基因频率的机制

-9.5 自然选择

-9.6 物种的形成

-9.7 地球上生命的历史

-第九章小测验--作业

第十讲动物和植物的结构和功能

-课前小短片

-10.1 动物的结构与功能

-10.2 反馈调节

-10.3 植物的结构和生长

-10.4 植物的营养和运输

-第十讲小测验--作业

第十一讲免疫系统

-课前小短片

-11.1 病原体

-11.2 免疫系统介绍

-11.3 先天性免疫

-11.4 适应性免疫中的受体识别

-11.5 体液免疫和细胞免疫

-11.6 免疫系统疾病

-11.7 免疫知识的应用

-第十一讲免疫系统--第十一讲小测验

第十二讲神经系统

-12.1 神经元的结构和功能

-12.2 静息电位和动作电位

-12.3 突触传导和神经递质

-12.4 神经系统的组成

-12.5 脑的结构和功能

-12.6 神经系统疾病

-第十二章小测验--作业

第十三讲生殖和发育

-13.1 激素的介绍

--13.1 激素的介绍

-13.2 内分泌系统

--13.2 内分泌系统

-13.3 动物的生殖---配子的形成

--13.3 动物的生殖---配子的形成

-13.4 动物的生殖---激素调节动物生殖

--13.4 动物的生殖---激素调节动物生殖

-13.5 动物的生殖---胚胎在子宫中的发育

--13.5 动物的生殖---胚胎在子宫中的发育

-13.6 动物发育(1)

-13.7 动物发育(2)

-13.8 动物发育(3)

-第十三讲小测验--作业

第十四讲生态学

-14.1 生态学的基本内容

-14.2 种群生态学

-14.3 种群间的相互作用

-14.4 生态系统

-14.5 生态系统中的物质循环

-14.6 生物多样性和物种

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