2.1 核酸提取在线视频

前两节课我们基本了解和掌握了

基因工程的基本概念及基本研究流程

基因工程主要通过切 接 转 增 检

表达等步骤来实现基因工程的实验

从中我们可以了解到

基因工程的研究对象是各种供体细胞

而供体细胞的核酸

是我们更为主要的研究对象

那么让我们了解一下核酸的分离纯化原则

与要求

首先了解它的一般原则

第一 要保持核酸分子一级结构的完整性

是核酸结构和功能研究的最基本的要求

第二 排除其他分子的污染

从而保证核酸的纯度

那么在分离纯化核酸时

我们需要有什么样的要求

为保证核酸的完整性

在实验中我们必须注意以下事项

第一 尽量简化步骤缩短提取时间

减少各种有害因素对核酸的破坏

第二 减少化学因素对核酸的降解

我们知道核酸的最适PH是4到10

所以我们必须将核酸保证在该PH范围内

第三 防止核酸的生物降解

细胞内外的各种核酸酶会将核酸进行破坏

所用所用器械和一些试剂均需高压灭菌

提取缓冲液中须添加核酸酶抑制剂

操作温度应在摄氏0到4度

其中我们还应该注意

DNA酶需要金属离子镁离子 钙离子的激活

因此使用金属离子螯合剂

如EDTA或柠檬酸盐等

阴离子表面活性剂SDS

在提取RNA时我们要知道RNA酶分布广泛

极易污染样品

而且RNA酶耐高温耐酸碱不易失活

所以在提取RNA时需将所用的各种器械

用0.1%的焦炭酸二乙酯浸泡

或将金属或玻璃器械用摄氏180度

干烤八小时

第四 要减少物理因素对核酸的降解

主要是机械剪切力其次是高温

机械剪切力主要包括强力高速的震荡

突然暴露于低渗液及样品的反复冻融

而高温指的是长时间的煮沸

那么我们怎么来保证核酸纯度的要求

可将诸如蛋白质 多糖和脂类分子等

非核酸生物大分子的污染降到最低程度

其次是排除其它核酸分子的污染

如制备RNA时DNA分子即为污染物

所以要用DNA酶将DNA分子进行降解

第三 去除对后续实验有影响的物质

如有机溶剂和高浓度的金属离子

那么我们现在来了解一下核酸的制备过程

即先准备材料接着破碎细胞

将内容物释放再实施核酸的分离

最终进行核酸沉淀纯化并去除杂质

然后将核酸溶解在适量的缓冲液中

进行保存备用

那么破碎细胞的常用方法有液氮研磨法

高速组织捣碎机破碎法

玻璃匀浆器匀浆法 超声波处理法

还可以运用溶菌酶 纤维素酶等生化方法

也可以运用SDS 吐温80等

表面活性剂进行化学处理

那么第二步就是实施核酸分离

及去除蛋白质的步骤

首先要加入SDS破坏细胞膜

抑制核酸酶使核酸从蛋白质上游离出来

接着要加入浓盐溶液

一般实验中是添加氯化钠

核酸蛋白质一旦加入氯化钠后

其静电吸力被破坏从而氢键被破坏

使核蛋白被解聚

第三就是使用酚 氯仿

能增强去除蛋白的效果

并对核酸酶有抑制作用

氯仿比重大能加速有机相与水相分层

减少残留在水相中的酚

同时氯仿具有去除植物色素和焦糖的作用

在酚氯仿抽提核酸提取液时需要震荡

为防止气泡和促使水相与有机相的分离

再加上一定量的异戊醇

那么酚氯仿异戊醇就按25比24比1的比例

进行配置

因先前抽提的核酸含有各种杂质

并且浓度较低所以需要进行沉淀

通过该步处理

能去除溶液中某些盐粒子与杂质

改变核酸的溶解缓冲液

从而起到浓缩作用

现在可以利用硅胶膜特异吸附核酸

有机酸沉淀法是最常用的核酸沉淀法

当核酸溶液的PH值大于4时

核酸分子成多聚阴离子状态

而当钾钠镁及铵根的阳离子形成的盐

通过屏蔽带负电的磷酸基团

使DNA分子聚集在一起

而不溶于许多有机溶剂

核酸沉淀的盐类及其浓度如下表所列

除了前述的有机盐外

常用的有机沉淀剂还有乙醇

异丙醇与聚乙二醇

首先了解一下乙醇

作为核酸沉淀剂的优缺点

乙醇对盐类沉淀少

沉淀中所含小剂量乙醇易挥发除去

不影响后续实验

而其缺点在于所需的乙醇量大

且需要在低温条件下操作

接着了解一下异丙醇

作为核酸沉淀剂的优缺点

它作为沉淀剂所需量小速度快

适于浓度低 体积大的DNA样品沉淀

一般不需低温长时间放置

而缺点是易使盐类 蔗糖与DNA共沉淀

且它难以挥发除去

所以最后需用70％乙醇漂洗数次

再了解一下聚乙二醇

作为核酸沉淀剂的优缺点

优点是可选择利用不同的PEG沉淀

相对分子质量不同的DNA片段

应用PEG6000进行DNA沉淀时

使用浓度与DNA片段的大小成反比

在使用聚乙二醇沉淀核酸时

需添加0.5摩尔每升的氯化钠

或10毫摩尔每升的氯化镁

最后再让我们了解一下

沉淀核酸时的注意事项

当沉淀时间有限时

用预冷的乙醇或异丙醇沉淀

沉淀就会更充分

沉淀时加入10分之一体积的醋酸钠

pH5.2 3摩尔浓度

有利于充分沉淀

沉淀后应用70％的乙醇洗涤以除去盐离子

这时一定要将沉淀悬浮起来

一定要控制时间

且要少量多次及彻底去除上清

最后得将乙醇充分挥发晾干

不过不要过分干燥

用TE缓冲液熔接分离纯化的DNA

TE缓冲液中的EDTA

能螯和镁离子或锰离子

抑制DNA酶pH值为8.0

可防止DNA发生酸解

而用DEPC溶解分离纯化的RNA

随后可以将它们保存于负20度

或副80度

不过要提醒的是

核酸的保存稳定性与温度成反比

而与浓度成正比

还有就是在DNA溶液中

加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染

最后让我们简单了解一下基因组DNA

质粒DNA与RNA的分离纯化

这是DNA提取的一般流程

先了解一下基因组DNA的提取时

所需注意的几个方面

其一是要运用最新鲜材料

而低温保存的样品不要反复冻融

提取血液基因组DNA要选择有核细胞

如白细胞等

组培细胞培养时间不能过长

否则会造成DNA降解

含病毒的液体材料DNA含量较少

提取前需先行富集

其次细胞裂解时要注意

材料应适量 过多会影响裂解

导致DNA量少纯度低

针对不同材料选择适当的裂解预处理方法

植物材料主要用液氮研磨

动物组织用匀浆或者液氮研磨

组胚细胞主要用蛋白酶K处理

细菌主要用溶菌酶破壁处理

酵母用破壁酶或玻璃珠处理

而高温温浴时需定时轻揉振荡

在核酸分离纯化时要注意以下几个方面

当沉淀时间有限

使用预冷的乙醇或异丙醇沉淀

沉淀会更充分

沉淀时加入10分之一体积的醋酸钠

有利于充分沉淀

沉淀后应用70%的乙醇洗涤数次

晾干DNA让乙醇充分挥发

不要过分干燥

接着让我们了解一下

质粒DNA的分离与纯化

质粒是超螺旋 半开环的线性DNA

它的理化性质与一般核酸相似

但其抗切割和抗变形能力更强

所有质粒DNA的分离包括三个基本步骤

即培养细菌使质粒扩增

收集和裂解细菌

分离质粒DNA

有时根据需要还要纯化质粒DNA

选择何种方法分离取决于质粒的大小

大肠杆菌菌株

裂解后用于纯化的技术和实验要求诸因素

那么质粒DNA的分离纯化

需要注意一下诸方面

其一是材料准备

应使用处于对数期的新鲜菌体

老化菌体会导致开环质粒增加

培养时应加入筛选压力

否则菌体易造成污染质粒易丢失

尽量选择高拷贝的质粒

如为低拷贝或大质粒则应加大菌体用量

菌株不要频繁转接

以预防质粒的丢失

其二是细胞裂解时应注意菌体量适当

培养基去除要干净

同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮

变性时间不要过长否则质粒易被打断

复性时间也不宜过长

否则会有基因组DNA的污染

酵母质粒的提取

应先用酶法或机械法处理

以破壁保证DNA的释放

其三是核酸分离纯化时所需要注意的事项

采用吸附材料吸附方式

分离DNA时应提供相应的缓冲体系

采用有机抽提时应充分混音

但动作要轻柔

离心分离两相时应保证一定的转速和时间

针对不同材料的特点

在提取过程中辅以相应的去杂质的方法

最后让我们来了解一下RNA的分离纯化

因为RNA易被RNA酶水解

而该酶除细胞内还广泛存在于

人的皮肤唾液汗液及周围的环境中

RNA酶分子结构中的二硫键

使其生物活性非常稳定

因此排除该酶的污染

是RNA制备成功与否的关键

所有RNA的提取过程中都有五个关键点

第一 样品细胞和组织的有效破碎

第二 有效地使核蛋白复合体变性

第三 对内源RNA酶的有效抑制

第四 有效地将RNA

从DNA和蛋白混合物中分离

第五 对多糖含量高的样品

还牵涉到多糖杂质的有效去除

最关键的是抑制RNA酶的活性

本节课就到这里 谢谢大家