4.2 转化在线视频

大家好

上次课给大家介绍了各种受体细胞的特点

这次课给大家介绍目的基因

是如何导入受体细胞的

首先我们来了解几个概念 转化

重组质粒DNA分子通过与膜蛋白的结合

进入受体细胞

并在受体细胞内稳定维持

和表达的过程称之为转化

通常情况下我们指质粒或者是粘粒

或者是质粒导入酵母细胞

再来看转染

转染是将重组的λ噬菌体DNA分子

直接导入受体细胞的过程

我们称之为转染

也就是将外源的DNA

导入除酵母以外的真核细胞中

再来看转导

也就是我们所说的感染

它是指通过λ噬菌体颗粒

感染宿主细胞的途径把外源DNA分子

转移到受体细胞内的过程

它是用噬菌体颗粒

去感染细菌

或者是用病毒颗粒

去感染哺乳动物细胞

重组DNA分子是如何导入原核细胞的呢

首先我们来看一下重组质粒DNA分子

转化大肠杆菌

我们知道有一些细菌它不包括大肠杆菌

能够自然的发生转化的过程

我们被称之为遗传感受细菌

大肠杆菌中转化不能够自然的发生

不过通过钙离子处理以后

大肠杆菌也具备摄取DNA的能力

也就是我们常说的制备感受态细胞法

那什么是感受态细胞呢

它指处于能够吸收周围环境中

DNA分子的生理状态的细胞

我们把这样的细胞呢就称之为感受态细胞

细胞的制备一般是利用大肠杆菌

然后通过氯化钙处理

步骤如下

第一 取适量菌种接种到LB液体培养基中

220转每秒的速度

37摄氏度培养16小时左右

第二 过夜菌中

取250微升加入到新鲜的

25毫升的LB培养基中

同样是220转每秒的速度

37摄氏度摇1.5小时左右

我们知道这个时长是一个经验值

一般都为1到2小时

OD600等于0.4的时候停止

第三 我们要对它的活菌数进行检测

它的活菌数务必少于10的8次方个每毫升

第四 取3到4毫升的菌液

转移到灭菌的离心管中

4摄氏度5000g的离心力

离心10分钟

然后去掉上清液

加入10毫升0.1摩尔每升的氯化钙缓冲液

进行悬浮

在水浴中冰浴10到20分钟

4摄氏度下2000g的离心力

离心15分钟

去掉液体加入1/5体积初始出发量

含20%甘油的0.1摩尔每升的氯化钙缓冲液

然后对它进行分装

保存到-70摄氏度即可

这个呢就是感受态细胞的制备

那我们是如何进行转化的呢

转化过程为第一

取0.2 ml新制备好的感受态细胞

在其中加入缓冲液溶解的重组DNA分子

置于冰上冰浴1小时以上

期间轻摇几次

第二 转入42摄氏度水浴2分钟

使感受态细胞吸收重组的DNA分子

第三 转入到37摄氏度上水浴5分钟

然后加入0.8毫升

不含选择性药物的LB培养基

在37摄氏度下

震荡培养30到60分钟

取10到100微升进行涂抹平板

培养过夜以后筛选转化子

细菌摄取DNA的确切机制尚未知晓

而氯化钙诱导转化的可能原因是

在0摄氏度的时候氯化钙低渗溶液中

细菌细胞发生膨胀

同时钙离子使细胞膜

磷脂层形成液晶结构

促使细胞外膜与膜间隙中的部分

核酸酶解离下来

诱导大肠杆菌形成感受态

钙离子能与加入的DNA分子结合

形成抗DNA酶的复合物

并粘附在细菌的细胞膜表面

42摄氏度短暂处理细菌细胞时

细胞膜的液晶结构发生剧烈的震动

并随之出现许多间隙

为DNA分子提供了进入细胞的通道

摄取质粒DNA的细胞就被称之为转化子

另外一种常用的转化方法为

电穿孔转化法

其基本原理是利用电穿孔仪的

高压电冲作用

在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔

形成可逆的瞬间的通道

从而促进外源DNA的有效吸收

转化效率受电场强度

脉冲时间和外源DNA浓度的影响

转化是否成功率 转化率是多少

我们就通过转化率来进行计算

什么是转化率

它指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率

它的计算方法是

转化率可以等于转化子数比上DNA分子数

或者转化子数比上DNA的质量

而影响转化率的因素主要有

第一 重组DNA分子的大小 构型 浓度

纯度及载体与受体细胞的一个亲和性

第二菌株的类型

第三 转化的方法

比如电穿孔法要好于氯化钙诱导法

而重组λ嗜菌体DNA分子

直接转导大肠杆菌的效率很低

所以对重组的λ噬菌体DNA

进行体外包装后

再通过转导的方法感染大肠杆菌

那什么是体外包装呢

它是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子

在受体细胞内发生的一系列特殊的

包装反应过程

将重组λ噬菌体DNA分子包装成

成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术

其原理是根据λ噬菌体DNA分子

体内包装途径

分别获得缺失D包装蛋白

的λ噬菌体突变株和缺失E包装蛋白的

λ噬菌体突变菌株

由于两种突变株均不能具有完整的包装蛋白

都不能单独的包装λ噬菌体DNA

但是将两种突变株分别感染大肠杆菌后

从中提取缺失D蛋白的包装物

和缺失E蛋白的包装物

两者混合后就能够包装λDNA

接下来了解重组DNA分子转入真核细胞

由于真核生物的细胞结构

基因组成和基因表达较为复杂

适用于原核生物的转基因方法

大多难以有效的用于真核生物

但近年来经过摸索

建立了一系列适用于真核生物的转基因方法

并用这些方法有效的获得了转基因真核生物

首先我们来看一下重组DNA分子

导入植物细胞

常用的方法有农杆菌介导的

Ti质粒载体转化法

因为农杆菌能侵入植物伤口处细胞中

其所具有的内源质粒-Ti质粒的

T-DNA能转移至细胞内部

因此将外源基因与Ti质粒重组构建载体

通过农杆菌介导

可将外源基因导入植物细胞

还有基因枪法

利用高速运行的金属颗粒

轰击细胞时能进入细胞

将包裹在金属颗粒表面的

外源DNA分子随之带入细胞

这就是基因枪法

我们再来看显微注射法

显微注射法是一种利用显微操作仪

通过机械的方法把外源DNA

直接注入细胞质或细胞核的基因转移法

早期该技术主要用于

动物细胞的基因转化等方法

现在逐步应用到植物细胞的转化操作中

成为一种重要的植物转基因手段

多聚物介导法

一些多聚物比如

聚乙二醇 多聚赖氨酸和二价阳离子

比如钙离子 镁离子 锰离子等

与DNA混合

能在原生质体表面形成沉淀颗粒

通过原生质体的内吞噬作用

而被吸收进入细胞内

激光微束穿孔转化法

利用直径很小

能量很高的激光微束在细胞膜上

造成可逆的微孔

处于细胞周围的DNA分子随之进入细胞

再有超声波介导转化法

同样是利用超声波处理原生质体

使细胞膜上形成可逆的微孔

使外源DNA进入细胞

再来看一下脂质体介导法

脂质体它是由人工构建的磷脂双层分子

组成的膜状结构

可以将DNA包裹在其中

并通过脂质体与原生质体的融合

或由于原生质体的吞噬过程

把外源的DNA转移到细胞内

对于植物而言还有一种方法是

花粉管通道法

此法是将外源DNA涂于授粉的枝头上

使DNA沿花粉管通道

或传递组织通过珠心进入胚囊

转化还不具正常细胞壁的卵

合子及早期的胚胎细胞

另外电转化法也是外源DNA

转入植物细胞的常用的方法

最后我们来看一下重组DNA分子

导入哺乳动物的细胞

哺乳动物细胞很难捕获外源DNA

这影响了哺乳动物基因工程的发展

但是呢通过几年的研究摸索

也建立了几种有效的将外源DNA

导入哺乳动物细胞的方法

首先我们来看一下

病毒颗粒转导法

带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞

目的基因随病毒DNA分子

整合到受体细胞染色体DNA上

带有目的基因的病毒是缺陷型的

须同另一辅助病毒一起感染受体细胞

在细胞内包装成新的病毒颗粒

还有就是磷酸钙转染法

哺乳动物的细胞能捕获黏附在细胞表面的

DNA-磷酸钙沉淀物

使DNA转入细胞

DEAE-葡聚糖转染法

就是二乙胺乙基葡萄糖

它是一种高分子质量的多聚阳离子试剂

能够促进哺乳动物细胞捕获外源DNA

实现短时间的有效表达

另外还有跟导入植物细胞类似的方法

比如显微注射转基因技术

电穿孔DNA技术

脂质体借导法等

都可以将外源的DNA导入

哺乳动物细胞

以上则是我们这节课所要介绍的内容

谢谢