4.3 重组子的筛选和鉴定在线视频

大家好

这次课给大家介绍重组子的筛选和鉴定

在重组DNA分子的转化

转染或是转导过程中

并非所有的受体细胞

都能被导入重组DNA分子

一般仅有少数的重组DNA分子

能够进入受体细胞

再者这些被转化的受体细胞中

除部分含有我们期待的DNA分子外

另外一些还可能是由于载体自身

或是一个载体与多个外源DNA片段

形成的非期待的重组DNA分子

导入所致

因此必须借助各种筛选和鉴定方法

区分转化子与非转化子

重组子与非重组子

目的重组子与非目的重组子

首先我们来看几个概念

第一 转化子

转化子它是指

导入外源DNA分子后

能稳定存在的受体细胞我们就称之为转化子

第二 重组子

它是指含有重组DNA分子的转化子

我们就称之为重组子

第三 阳性克隆子

也就是我们的目的重组子

它是指含有外源目的基因的重组子

第四 筛选或者说是选择

是经过各种方法

将外源DNA导入受体细胞后

获得的阳性克隆子的过程

称之为克隆子的筛选或选择

进行筛选的方法主要有以下几类

第一类是遗传表型直接筛选法

在构建基因工程载体时

载体DNA分子上

通常携带了一定的选择性遗传标记基因

转化或转染宿主细胞后

可以使后者呈现出特殊的表型

或遗传学特征

据此可进行转化子或重组子的初步筛选

一般的做法是将转化处理后的菌液

包括对照处理

适量涂布在选择培养基上

在最适生长温度条件下培养一段时间

观察菌落生长情况

即可挑选出转化子

最常用的直接筛选法有抗药性筛选

比如抗氨苄青霉素 氯霉素

卡那霉素 四环素 链霉素等性质

主要用于重组质粒DNA分子的转化子筛选

筛选原理是在含相应抗生素的培养基上

含重组质粒的受体菌能够存活

不含重组质粒的受体菌不能够存活

再有是利用显色互补筛选法

也就是我们所说的LacZ’基因的蓝白斑筛选

它工作原理

我们在之前介绍载体的时候有介绍过

他是利用大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶

可以将无色化合物X-gal

切割成无色的半乳糖和深蓝色的物质

5-溴-4-靛蓝

通过颜色的变化来进行筛选

实验中在IPTG的诱导下

有外源基因插入的菌落呈现白色

而只有空质粒转入的菌落呈现蓝色

再有是形成嗜菌斑筛的选法

对于λDNA载体系统

在只有外源DNA插入载体后

重组的λDNA分子大小

在野生型λDNA分子的78%

到105的范围内时

才能在体外包装成具有

感染能力的噬菌体颗粒

后者在转导受体菌后

转化子在培养基上被裂解形成嗜菌斑

而非转化子能够正常生长

两者很容易区分

第二类检测方法是DNA电泳法

可分为直接电泳检测法

因为重组的质粒DNA分子

由于有外源的DNA的插入

比未插入外源DNA的质粒载体要大

通过凝胶电泳就可将重组子筛选出来

第二是限制性酶切图谱法

限制性酶切图谱法就是对载体上

插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析

并以此与目的基因的已知图谱对比

因此利用这种方法

不仅能够区分重组子与非重组子

而且能够鉴定目的重组子

连接前用什么酶就用什么酶切

但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时

工作量极大实验成本也较高

还有PCR检测法

是用特序列引物通过PCR扩增外源DNA

然后对扩增产物进行电泳

就可筛选出阳性克隆子

外源DNA的两侧序列多为已知序列

如利用克隆位点两侧序列

设计引物进行PCR

再结合序列分析

能可靠地证实插入片段的方向

序列和阅读框的正确性

第三类方法是核酸分子杂交法

带有互补序列的DNA或者RNA

其相应的同源区段就会退火形成双链结构

如果退火的核酸来自不同的有机体

形成双链分子

就被称为“杂种核酸分子”

DNA和DNA杂交能揭示亲缘关系的远近

二DNA与RNA的杂交也可用来揭示

核酸片段中特定基因的位置

核酸杂交通常采用一种带上放射性同位素

或荧光标记的

纯的单链DNA或者RNA作为探针

从一个大的未知的DNA或者RNA群体中

筛选到与之互补的同源DNA或RNA序列

基因探针根据标记方法不同

可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类

根据探针的核酸性质不同

又可分为DNA探针 RNA探针

cDNA探针 cRNA探针

及寡核苷酸探针等几类

那核酸探针的来源主要有三个方面

第一 目的基因的部分已克隆序列

第二 与目的基因同源性很高的

已克隆的其它基因

第三就是寡核苷酸探针

杂交的方法

主要有

原位杂交

Southern 印迹杂交

Northern 印迹杂交

以及Western 印迹杂交

其中原位杂交亦称菌落杂交

或噬菌体杂交

这是因为生长在培养基平板上的

菌落或噬菌斑按照其原来的位置

不变地转移到滤膜上

并在原位发生溶菌

DNA变性和杂交作用

这种方法对于从成千上万的菌落

或噬菌斑中鉴定出含有重组体分子的

菌落或者噬菌斑具有特殊的实用价值

Southern 印迹杂交

是DNA DNA分子间的杂交

它在重组子检测的主要用途是

第一 可确定在克隆片段中

基因编码区的大小和位置

二 确定克隆片段在基因组中的拷贝数

Northern杂交总体过程

与Southern 杂交相似

只不过在转移的过程中

转移的是RNA而不是DNA

Northern杂交主要用来检测细胞

或组织样品中是否存在

与探针同源的mRNA分子

从而判断在转录水平上某基因是否表达

通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱

Western杂交也与Southern杂交相似

只不过转移的是蛋白质

而不是DNA

这种将蛋白质样品

从SDS-PAGE凝胶通过电转移方式

转移到滤膜的方法

称为Western blotting

其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交

而是通过抗体以免疫反应形式

检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质

并判断其分子量

所用的探针不是DNA或者是RNA

而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体

第四类检测方法是免疫化学检测法

直接的免疫化学检测技术

同菌落杂交技术在程度上是十分类似的

它利用抗体鉴定

引起产生外源DNA编码的

抗原的菌落或噬菌斑

只要当一个克隆的目的基因

能够在大肠杆菌寄生细胞中实现表达

合成出外源的蛋白质

就可以采用免疫化学法进行重组体的检测

免疫化学检测法

可分为放射性抗体测定法

和免疫沉淀测定法

这些方法最突出的优点是

它们能够检测不为寄主

提供任何可选择的

表型特征的克隆基因　　

放射性抗体测定法

利用放射性同位素标记抗原或抗体

然后与被测的抗体或抗原结合

形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的

而免疫沉淀检测法

它检测分泌型产物

原理是抗原 抗体凝集反应

把非放射性抗体加到平板培养基中

当插入基因的表达

产物被细菌分泌到菌落周围时

就会与抗体反应形成“沉淀圈”

也就是是白色圆圈

另一种免疫检测法是酶联免疫检测法

也就是我们说的ELISA

采用非放射性标记物

比如辣根过氧化物酶

或是碱性磷酸酶等

偶合第二抗体

然后与目的蛋白抗原 抗体复合物结合

通过检测非放射性物

从而检测到相应的蛋白抗原

二抗上携带一种酶

能催化一种反应将无色的底物

转变为有色的物质或者是能发光

再通过比色测定有色物质的含量

或者是光的强度

从而推测目的分子的含量

第五类是转译筛选法

转译筛选法是通过体外转译的手段

鉴定阳性克隆的方法

可分为杂交抑制转译

和杂交选择转译两种检测方法

第六类是核苷酸序列测定

是最准确的鉴定目的DNA的方法

可明确序列和阅读框的正确性

序列测定的原理及方法

在下节课将由李晓然老师给大家具体介绍

这次课我们讲到这里

谢谢大家