3.3 病毒载体在线视频

大家好

这次课主要给大家介绍病毒载体

病毒主要由DNA或RNA和外壳蛋白组成

经包装后成为病毒颗粒

经过感染病毒颗粒进入宿主细胞

利用宿主细胞的合成系统

进行核酸复制和外壳蛋白的合成

实现病毒颗粒的增殖。

其中温和型病毒

是构建病毒颗粒载体的好材料

我们知道噬菌体是一类细菌病毒

他的生活周期可分为

溶菌周期和溶原周期

具有溶原周期的温和噬菌体

是作为噬菌体载体的材料

根据噬菌体DNA结构特点

噬菌体载体可以分为

单连噬菌体载体以及双链噬菌体载体

首先我们来看一下单链DNA噬菌体的

载体的特点

第一它具有正译的DNA链

而它的复制型

是双链的环状的DNA单链的DNA

复制型的DNA和单链的DNA

都能够转染感受态大肠杆菌

并产生噬菌斑

它不存在包装的限制

可产生大量的含有外源DNA插入片断的

单链分子便于作探针或测序

我们以M13噬菌体为例

给大家介绍一下单链DNA噬菌体载体

M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌

DNA的长度为6.4个bp左右

它的生活周期为M13

通过雄性细菌的F性须注入其单链的DNA

其正译链的DNA合成反译链的DNA

形成复制型的双链DNA

反译链DNA转录成mRNA

合成正译链的DNA

翻译形成噬菌体蛋白

组装成新的噬菌体

然后再挤出寄主细胞

再来看M13载体的构建

首先我们要选择克隆区域

M13基因组织中在基因四与基因五之间

存在一段507个bp的基因间隔区

间隔区存在M13复制的起点

但可以插入外源DNA

并且不影响M13噬菌体的活力

并且这个区域内只有一个内切酶位点

构建的第二步就是加入酶切位点

在基因间隔区 内加入单 一的酶切位点

就是形成了M13mp1

噬菌体载体在基因间隔区内

插入一个大肠杆菌的LacZ’基因

也就是a-肽序列

利用a-肽序列中的三个单一是酶切位点

作为多隆位点

那M13载体系列它的命名是M13mpn

n代表系列数字

对M13mp1的改进

就是添加常用的内切酶位点

把LacZ’5’基因的第十三核苷酸

G突变成A

产生得了一个EcoR I的切点

然后再队M13mp2质粒

然后再对M13mp2的进一步改进

是在M13mp2的

LacZ’的5”端

加上一段人工合成的多克隆位点

成为M13mp系列载体

对应有相同的对克隆的pUC系列载体

M13系列载体的优点

第一有多克隆位点

便于克隆不同的酶切片段

第二它是通过X-gal显色反应的

可以提供直接选择

第三无包装限制克隆能力大

第四可以克隆双链DNA中的每一条链

而M13载体的缺点

就是插入外源DNA以后

它的遗传稳定性显著下降

并且它的实际克隆能力是小于1500个bp的

下边给大家介绍一下双链噬菌体载体

λ载体

首先我们来看一下它的分子特点

它的长度是48502个bp

它为双链线性的DNA

但是两边有cos位点可以环画

那什么是cos位点呢

就是 λDNA两端各有12个bt的粘性末端

粘性末端形成的双链区域就称之为cos位点

在λDNA进入细菌体以后

可形成双链环状的DNA复制型

就它的基因组成

又有什么特点呢

λDNA上有之少61个基因

有一半是必须的

以自身的活动相关

成簇排列

其它的约1/3是必需基因

位于尾部合成至阻遏之间的一个区段

针对这一特点λ噬菌体的载体构建

基本原理就是删除λ噬菌体的非必须区

流出插入空间

构建工程可以分为

第一在这个非必须区内制造限制性酶切位点

第二引进某些突变表型

作为选择标记

第三突变某些基因使它成为安全载体

第四删除λDNA必须区段上

常用的限制性内切酶位点

λDNA载体的优点

它比一般的质粒载体的容量要大很多

用在真核生物基因组文库的建立上

接着给大家介绍另一种载体

cos载体也就是我们说的粘粒

它主要包括了两个载体的部分组件

一个是λDNA的cos序列

和控制包装的序列

以及pBR322质粒的复制子抗性基因

以及几个限制性内切酶的单一位点

因此它既具有λ噬菌体的特征

在寄主细胞内形成环化DNA

但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌

克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒

又具有质粒载体的特性

大多带有pMB1或者是ColE1的复制子

能像质粒一样复制

另外还具有抗菌素抗性基因

和插入失活的克隆位点

以及高容量的克隆能力

应用柯斯质粒做为载体

在大肠杆菌细胞中

克隆基因组大片段DNA的技术

就称之为柯斯克隆

常用的病毒载体

腺相关病毒 猴肾病毒SV40

逆转录病毒和昆虫杆状病毒等

其中腺病毒载体是目前在基因治疗中

最常用的载体之一

腺病毒的基因组

它是线状的双链DNA病毒

其中基因组中有14个基因

共同特点是都带有倒置的末端重复

是病毒复制的起始点

腺病毒的优点在于 第一

它无囊膜的20面体病毒

宿主范围广

不仅能感染有分裂能力的细胞

也能够感染不能分裂的细胞比如神经细胞

它可以在呼吸道和肠道中繁殖

可以通过口服或者是喷雾的方式感染

第四 载体中的插入片断可达到7.5个kb

另外腺病毒容易制备 纯化

它的基因组结构和功能了解得清楚

它比较安全 没有致病

致癌 致畸的作用

对于腺病毒载体的构建

是利用用同源重组的方法

插入外源基因主要包括以下几个步骤

第一删除腺病毒DNA一些非必需区

比如E1或者是E3区

增加插入能力

形成E1或者是E3缺失病毒

第二构建质粒载体

在E1或者E3区两侧的同源序列之间

插入外源基因和选择标记基因

第三 把质粒切成线性

第四 共同转染细胞在细胞中发生同源重组

把外源DNA加到病毒基因组中

并包装成重组病毒颗粒

下边我们来看一下大分子DNA克隆载体

人类 动物 植物的全基因组序列分析

往往需要克隆数百甚至上千个

kb的DNA片段

此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量

也远远不能够满足需要

将细菌接合因子或酵母菌染色体上的

复制区 分配区 稳定区与质粒组装在一起

即可构成染色体载体

当大片段的外源DNA

克隆在这些染色体载体上后

便形成重组人造染色体

它能够像天然染色体那样

在受体细胞中稳定的复制并遗传

目前常用的人造染色体载体包括

酵母人工染色体载体YAC

和细菌人工染色体BAC

它只能在酵母细胞中扩增

克隆容量大

大约是在230个kb到1700个kb之间

而BAC在大肠杆菌F因子的基础上构建的

因此具有单拷贝复制

它的克隆容量可以达到300个kb

比较稳定每个细胞只有一个拷贝

不会重组

能像提取质粒一样的直接提纯

以上为基因工程载体的内容

从下次课开始

将给大家介绍目的基因转入受体细胞

及重组子的筛选与检测

谢谢大家