2.7 工具酶在线视频

同学们大家好

在基因工程的学习中

酶是非常重要的工具

基因工程中绝大多数方法和操作

都是酶促反应过程

我们对基因进行操作的时候

所用到的剪刀 胶水都是酶在起作用

因此多种多样的工具酶

是基因工程的必要条件

我们为什么把酶放在本章的最后来讲呢

因为我们在本章学习了外源基因的获得

马上就要学习怎么把这个外源基因

放到环状的质粒当中去

所以我们来学习一下

这个剪刀和胶水都是怎么工作的

原核生物对于基因工程

真的是非常非常重要的

几乎所有的基因工程操作

都需要原核生物中验证

原核生物也为我们提供了很丰富的酶资源

比如限制性内切酶

这是个非常奇怪的名字

它到底是什么意思呢

我们分开来看

首先这是个内切酶

这个好理解

可以水解核酸分子链内部磷酸二酯键的酶

与核酸外切酶相对应

最早是在细菌中发现的

细菌利用内切酶降解进入细胞内的外源DNA

可是内切酶怎么判断哪个DNA是外来的

哪个是自己基因组内的呢

是通过甲基化

细菌自身的基因组的部分碱基是甲基化的

而内切酶是可以区分甲基化DNA的

只会水解没有被甲基化的DNA

也就是说这个内切酶是的酶切有限制的

这个系统在细菌上叫做限制-修饰系统

这种酶叫做限制性内切酶

在原核生物中

已经发现了1000多种限制性内切酶

它们的主要特点是识别特定的DNA序列

再从某个地点切开

原核生物内有三种类型的限制修饰系统

我们在基因工程中最为常用的是II型

我们通常所说的限制性内切酶

也指的是II型的内切酶

接下来我们先简单的了解一下

I型和三型限制修饰系统

这两个酶的最主要特点

都是切割位点和识别位点有一定距离

差别在于距离的远近

I型和III型的酶

都是既可以识别序列和切割

同时也可以甲基化的

这两个酶的识别位点都是不对称的5到7个bp

这两种酶很难产生特定的核苷酸片段

在基因工程中很少用到

我们就不过多的讲了

接下来我们主要来说一下II型限制修饰系统

与I型和III型不一样

II型限制修饰系统是由两种酶

来分别行使甲基化和识别位点切割的功能

我们在基因工程中常用的就是

能够识别位点和切割的酶

这个酶的识别位点是4个或者6个碱基

而且必须是回文序列对称的结构

找到了对称的识别位点

一般就在识别位点的地方进行切割

可以产生整齐的平末端

或者像木工里的榫卯结构一样的粘性末端

II型限制性内切酶在基因工程中

有非常广泛的应用

它们有固定的切割位点

可以得到确定的末端

因此也被称为基因的剪刀

下面我们来深入了解一下

II型限制性内切酶吧

首先我们要给它一个名字

限制性内切酶是按照它的来源来命名的

举个例子EcoRI

前三个字母是大肠杆菌的种属名缩写

所以这仨个字母是需要斜体的

大写字母R是菌株名

最后的罗马字母I代表是在这个菌株中

分离的第一个限制性内切酶

这样的命名规则会产生一种现象

两个名字不一样的酶

可能会具有相同的识别和切割序列

我们叫它同裂酶

还有一种来源也不同

识别和切割序列也不一样

但是切出来的粘性末端是一样的

这样的酶叫做同尾酶

限制性内切酶可以用三种方式进行切割

DNA被限制性内切酶水解后

在切割位置可以形成粘性末端

和平末端的结构

根据回文序列的对称轴来说

在对称轴切割产生平末端

在对称轴的5’侧切割产生5’末端

在3’侧切割产生3’末端

有相同粘性末端可以通过碱基互补配对

重新形成氢键

无论两个粘性末端是不是来自同一个DNA

在实际的实验操作中

限制性内切酶的反应受到以下因素影响

第一 温度

酶的最适温度一般为37度

也有特殊的

相同的酶由不同的公司生产

可能会有不同的反应温度

要仔细阅读说明书

第二 缓冲液

不同的酶适合不同盐浓度的缓冲液

一般情况下

酶的试剂盒中会有相应的缓冲液

第三 反应时间取决于酶和DNA的含量

一般要反应一小时以上

第四 反应体积和甘油浓度

酶一般保存在甘油溶液中

所以不能盲目的增加酶的用量

第五 底物DNA的纯度和活性

如果DNA中所含杂质

或者其自身被甲基化就会影响酶切反应

最后如果甘油浓度

离子浓度发生变化

有些酶的识别序列都会发生变化

称为限制性内切酶的星号活性

在实际实验当中选择限制性内切酶

要根据酶切产物的后续实验来确定酶切位点

继而选择合适的限制性内切酶

接下来我们来学习核酸酶

顾名思义是可以水解核酸的酶

能够切断磷酸二酯键

根据其起作用的对象

可以分为DNA酶和RNA酶

比如DNA酶I

可以水解单链或双链的DNA

RNA酶A是专门降解RNA的

非常稳定的酶

我们在实验中要注意

如果实验室近期用过RNA酶A

那就尽量不要再进行RNA相关实验了

会被RNA酶A降解掉

RNA酶为什么难以去除

大家还记得吗

分子生物学中讲到蛋白质的折叠里面

有一个自发折叠的例子

说的就是RNA酶A

即使经过热处理变性

它还是可以通过自发折叠恢复活性

还有些核酸酶针对RNA和DNA都可以起作用

比如S1核酸酶

可以降解单链的DNA或RNA

产生单核苷酸或寡聚核苷酸

根据核酸酶作用的位置不同

又可以分为核酸外切酶和核酸内切酶

核酸外切酶从DNA或RNA链的一端

逐个水解下单核苷酸

核酸内切酶催化水解

多核苷酸内部的磷酸二酯键

我们在复习分子生物学讲到复制和转录

分别回顾了DNA聚合酶和RNA聚合酶的特性

我们只需要掌握核酸聚合酶的主要特性

是沿着5’到3’的方向合成磷酸二酯键

形成多核苷酸链

其次是3’到5’的外切酶活性

代表了校正活性

5’到3’的外切酶活性

可以进行切口平移

在基因工程中

作为工具酶的DNA聚合酶

主要有大肠杆菌DNA聚合酶I

T4DNA聚合酶和taq DNA聚合酶

大肠杆菌聚合酶I具有上述三个活性

但是经过枯草芽孢杆菌蛋白酶水解之后

产生一个大片段和小片段

大片段称为Klenow

也是基因工程中常用的酶

保留了聚合活性和校正活性

没有切口平移活性

大家熟悉的Taq DNA聚合酶

就没有校正活性

但是有5’到3’的外切酶活性

所以Taq酶可以用在

taqman探针方法的荧光实时定量PCR上

而PCR反应中用到的高保真酶Pfu

则具有校正活性

其产物具有比taq酶低得多的错误率

还有一个特殊的DNA聚合酶是逆转录酶

具有聚合活性没有校正活性

我们来简单了解一下

对核酸进行修饰的酶类

第一个是末端脱氧核苷酸转移酶

简称末端转移酶

是从小牛胸腺中纯化出来的

一种核酸修饰酶

这种酶不依赖DNA模板

在单链或双链DNA分子的3’末端

逐个添加脱氧核苷酸

当反应体系中只有一种dNTP时

就可以在3’末端

形成单一核苷酸的同聚物尾巴

在基因工程中

末端转移酶的主要用途是给外源DNA片段

和载体加上互补的同聚物尾巴

使它们可以方便的链接起来

还可以根据是否添加带标记的同聚物

来判断细胞中是否由于细胞凋亡

而出现了大量的3’羟基末端

第二个是T4多核苷酸激酶

来源于大肠杆菌的T4噬菌体

很多哺乳动物中也发现了这种激酶

这个酶在基因工程中

主要用来标记DNA的5’末端

还可以使缺失5’末端的DNA发生磷酸化

第三个酶是碱性磷酸酶

能够将单链或者双链DNA或RNA分子

脱去5’磷酸基团

碱性磷酸酶和T4多核苷酸激酶一起

可以标记DNA的5’末端

为了防止切开的载体分子自连

也需要将5’末端的磷酸基团去除

最后来介绍下甲基化酶

原核和真核生物中都存在大量的甲基化酶

原核生物中甲基化在限制修饰系统

DNA复制修复中都起到重要的作用

在哺乳动物细胞中

生殖细胞发育时期

和植入前胚胎期

其基因组范围内的甲基化模式

通过大规模的去甲基化

和接下来的再甲基化过程发生重编程

从而产生具有发育潜能的细胞

在细胞分化的过程中

基因的甲基化状态将遗传给后代细胞

由于DNA甲基化与人类发育

和肿瘤疾病的密切关系

DNA甲基化已经成为表观遗传学

和表观基因组学的重要研究内容

DNA连接酶

主要是将一个DNA片段的5’端

与另一个DNA片段的3’端

连接成磷酸二酯键

大肠杆菌DNA连接酶要求双链DNA中

有一条完整的单链可以作为模板

另一条单链中的切口位点

不能缺少任何核苷酸

切口有相邻的5’和3’末端

催化反应需要ATP

使单链切口形成磷酸二酯键

比如可以将冈崎片段连接起来

在DNA修复过程中

可以将断开的片段连接起来

T4 DNA连接酶比大肠杆菌DNA连接酶更有用

因为除了可以把一条链

有缺口的双链DNA分子

有互补粘性末端配对的两条双链DNA

作为底物外

还可以进行两个双链DNA分子之间的

平末端连接

因此T4DNA连接酶在基因工程中

有很多的应用

甚至没有别的酶可以替代

具有非常重要的意义

本节课关于工具酶的学习就到这里

大家再见