2.6 全基因组扩增及基因组研究在线视频

大家好

今天我们来讲全基因组扩增和基因组研究

Science杂志中有一句话

下一个伟大时代将是基因组革命时代

它正处于初期阶段

在当前的研究水平上

只要涉及生命体重要现象的课题

几乎离不开对基因及其作用的分析

对于有机体基因组的分析

是深入了解生命本质的重要开端

要进行基因组分析

我们首先要得到

足够现有技术分析的基因组DNA量

当遇到极端稀少样品的时候

我们需要进行全基因组扩增

首先我们来回顾下

我们常规的体外DNA扩增是什么样子的

首先我们需要模板

这是你要扩增的DNA来源

然后我们需要引物

引物决定了我要扩增的片段

在模板上的哪个位置

此外我们还需要酶

dNTP和缓冲液等扩增的工具

那么传统的PCR有没有什么缺陷呢

我想最大的问题就在于

传统PCR只能“在已知里面找已知”

因为我们设计引物需要依靠已知的序列

如果想要得知未知的序列信息就比较困难了

而且由于DNA聚合酶持续合成能力的限制

PCR扩增的长度是有限的

第二PCR对模板的量是有要求的

一般要求模板在纳克级别

对于大多数样品中得到的模板

这个数量级是没有问题的

但是有些特殊情况 比如法医鉴定

古生物 或者其他非常珍贵

稀少的样品是远远不够的

举个极端的例子

假如我们只有一个细胞

我需要分析它的相关情况

能得到多少DNA

以人为例

人的染色体中含有

3乘以10的9次方个碱基对

每个碱基对的摩尔质量是660克每摩尔

人是双倍体需要乘以2

再除以6.02乘以10的23次方

大约是6.6乘以10的负12次方

皮克级别的

这样的含量是不能用于普通的PCR扩增的

最后一点PCR是指数形式扩增的

其中如果出现了错误

这种错误会累积下去

并呈指数形式增长

所以PCR技术有无法消除的偏差

当然没有任何一种技术是完美的

各种技术都有自己的特点

适用于不同的实际科研情况

针对前面讲的传统PCR技术的几个问题

今天给大家介绍一项新的技术

基于多态性链置换扩增的全基因组扩增

这项技术来源于

一个从芽孢杆菌的噬菌体phi29当中

分离得到的聚合酶

首先这个酶有非常强的持续合成能力

可以连续合成超过70kb的DNA片段

第二这个酶对模板DNA的形态没有要求

可以是单链的

也可以是双链的

既可以是环状的

也可以是线状的

也就是说真核和原核生物的染色体

都可以直接作为模板进行扩增

1皮克的模板就可以用来扩增

也就是一个细胞的DNA

就足以用来进行全基因组扩增

也由此诞生了一种新的技术

单细胞基因组学

当然现在的单细胞基因组学

已经不再采用MDA的扩增方法了

而是用了基因组覆盖率更高的MALBAC

由于时间关系

我们在课上就不再详细讲了

有兴趣的同学可以自己去查阅相关论文

第三 Phi29这个酶的合成速度很快

大约是50个核苷酸每秒

大家回忆一下PCR中

常用的Taq酶的速度是多少

大约是10到20个核苷酸每秒

所以phi29聚合酶还是比较快的

也因此更适合用来进行全基因组扩增

第四 phi29聚合酶每次反应

可以得到3到5微克的产物

第五 这个酶是具有校正活性的

保证了较低的错误率

最后一点

Phi29酶进行扩增是不需要PCR仪的

因为它的反应温度只有30度

只要不是太热的天气

当然在昆明

一般室温是不会超过30度的

我们只要开一个30度的水浴锅

就可以让它反应啦

第二天早上 直接来收产物就可以了

接下来我们来讲一下基因组文库

当我们需要了解一个基因的编码顺序

和功能的时候

我们需要构建基因组DNA文库

随着二代和三代测序的发展

现在的基因组测序

已经不需要构建传统基因组文库了

在使用新的测序技术时

我们也会提到一个词叫做建库

这个文库和大家在基因工程课本上

看到的基因组文库的概念是不一样的

我们简单地区分一下

首先课本上提到的基因组文库

是把基因组打断成一定大小的片段

插入到载体中

再转入受体细胞

我们把包含基因组信息载体的受体细胞

的总和称为基因组文库

在测序技术水平比较低的时候

我们可以针对每一个受体细胞

长出来的单克隆进行测序

从中拼接出全基因组序列

这个工作量是相当庞大的

或者我们可以用一些选择性培养基

筛选出来含有某些功能片段的受体细胞

再进一步研究其序列和功能

这个基于功能的筛选现在依然还在使用

这一点是不能被测序技术所取代的

那么在测序中什么叫做建库呢

指的是做好准备工作

加好测序所需接头等

可以用于测序的样品中包含的序列的总称

其实两个文库的意思是相近的

只是准备工作不太一样

接下来我们来聊点轻松的

基因组研究是怎么开始的

现在进行到什么程度了

首先说说我们为什么要做基因组研究吧

基因组学是以分子 生物学技术

电子计算机技术和信息网络技术为手段

以生物体内基因组的全部基因为研究对象

从整体水平上探索全基因组

在生命活动的作用及其内在规律

和内外环境影响机制的科学

这个是基因组学的概念非常长

我用通俗的话来解释一下

每个物种每个个体都有独特的遗传物质

也就是说每个生命体

都有一定的ATGC的排列顺序

基因组研究的第一步

就是把这些排列顺序读出来

这就是结构基因组学

知道了这些顺序我们能读懂什么呢

什么都不知道这就是一本天书

所以第二步需要对这本天书进行翻译和注释

也就是说要告诉大家

这样排列的序列代表什么

它可以做什么

如果在体内正常表达能有什么功能

有什么产物

这个就叫功能基因组学

提到基因组学

就不得不提人类基因组计划

1984年一次由美国能源部的环境诱变

和致癌物防护国际会议上

科学家讨论有没有新方法

可在日本广岛 长崎原子弹爆炸后的幸存者

及其子女的群体中直接测定基因突变

随后人类基因组计划于1988年实施

原定15年于2003年完成全部顺序测序

实际花了13年

于2001年初宣布完成草图顺序

国际人类基因组计划一开始

是由大家都非常熟悉的

DNA双螺旋结构的发现者之一沃森主持的

后来与团队中的一位叫文特尔的科学家

因为人类基因是不是要申报专利发生了争执

沃森离开了人类基因组计划

大家可以猜一下

谁支持 谁反对呢

从这张照片我们可以看出来

文特尔专门穿了一件特制的实验服

加西装来告诉大家

他不仅仅是一名杰出的科学家

更是一名优秀的商人

显然文特尔是支持申报专利的

当然第一次用基因来申报专利

美国专利局没有经验

一个也没有批准

因此文特尔也离开了人类基因组计划

但是他成立了一家叫做

赛雷拉的基因公司

也做人类基因组测序

venter采用了一种叫做

鸟枪法的测序策略

并且取得了非常好的进展

在2001年在美国政府的协调下

快了一步的文特尔与多国政府

主导的人类基因组计划

共同宣布人类基因组计划完成了

我们简单的说一下什么是鸟枪法测序

严格来说

现在基于高通量测序的基因组

随机测序都是鸟枪法测序

鸟枪法又叫散弹法

shotgun sequencing

首先把基因组DNA

随机打断成适合测序的小片段

可以用超声等物理方法来打断

也可以使用不完全酶切的方法来打断

针对这些小片段直接进行测序

根据序列之间的重叠区域对序列进行拼接

就像我们玩的拼图玩具一样

每个小方块之间总是要有交叉的小圆圈

才能更方便的拼接到一起

在鸟枪法以前

需要先把基因组DNA打断成较大的片段

构建基因组文库

再针对每一个文库进行测序

鸟枪法节省了实验流程

但是对于后续的数据分析

则是大大的增加了工作量

但是现在测序技术的改进

超级计算机的进步

使得大部分物种的基因组学分析

可以直接使用随机测序来完成

有一点值得大家注意

即使人类基因组计划宣布完成

我们拿到的数据依然不是完成图

例如很多高等生物都含有

大量的高度重复序列

就像拼图时遇到一大块同样颜色的图

是完全不能拼的

这些地方的全基因组序列依然是空白

人类基因组计划花了34.5亿美元

几乎是一个碱基一美元

也可以告诉大家在二十年后的今天

测一个人的基因组的价格

只有不到一万人民币

这十几年间由于测序技术的飞速进展

测序长度增加 通量提高 价格降低

使得基因组学得到的突飞猛进的发展

用这个词一点也不夸张

我前几天在看一本写于20世纪初期的教材

上面写现在有一打的生物测了全基因组

于是我去查了一下

2018年的3月份已经有297217多个物种

进行了全基因组测序了

我们可以看到

在2006年和2017年前后

项目全基因组突然有了显著的上升

这就是二代测序和三代测序

有较大进展的年份

感兴趣的同学

可以去这个网站自己查找感兴趣的信息

这个是美国能源部

对啦就是主持人类基因组计划的部门

下属的联合基因研究所

的一个专门针对基因组研究的网站

好了我们今天就聊到这

下次课见