当前课程知识点：基因工程 > 第三章 质粒 > 3.1 蓝白斑筛选-有趣的蓝白斑筛选-根据颜色筛选菌株扥方法 > 3.1 蓝白斑筛选
同学们大家好
在前边的课程中柳老师和李老师
给大家介绍了目的基因的制备
从这次课开始我将给大家介绍基因工程载体
首先大家考虑一下基因克隆的本质是什么
是的就是使目的基因在特定的条件下
得到扩增和表达
但是目的基因本身是无法进行复制
因此就必须借助于“载体”
及其“寄主细胞”来实现
首先我们了解一下什么是基因载体
它是一类能自我复制的DNA分子
其中的一段DNA被切除而不影响其复制
可用以置换或插入外源DNA
而将目的基因带入受体细胞
那基因工程 载体有些什么要求呢
首先载体都能够携带外源的DNA片段
进入受体细胞
或停留在细胞质中自我复制
或整合到染色体DNA上
随着染色体DNA的复制而同步复制
第二 载体都具有
供外源基因插入的
限制性核酸内切酶位点
即多克隆位点
第三 载体都具有合适的遗传标记基因
第四 如果是表达载体
还应该具有表达调控元件
如启动子 增强子 终止子以及SD序列
基因复制的原理
限制性内切酶的作用
以及表达调控元件在之前的课程中
已经给大家介绍了
这次课主要给大家介绍一下
载体的选择性标记及其工作原理
首先我们来看一下
第一种它的抗菌素抗性
绝大多数载体都利用抗菌素抗性标记
比如氨苄青霉素抗性
卡那霉素抗性 四环素抗性等
那它的选择性原理是什么呢
就是不带有抗菌素抗性基因的受体菌
不能够在含有抗菌素的培养基
即选择培养基中生长
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后
受体菌才能够在选择培养基上生长
另一种载体常用的选择性标记方式是
蓝白斑筛选
它也是基因工程常用的重组菌筛选方法
就它的工作原理我们首先了解一下
参与的物质及其工作原理
第一 X-gal 它的中文名字
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷
野生型的大肠杆菌产生的
β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal
切割成半乳糖
和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝
有色物质可以使整个培养菌落
产生颜色变化
而颜色变化是鉴定和筛选的
最直观有效的方法
设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌
为β-半乳糖苷酶缺陷失型菌株
这种宿主菌的染色体基因组中
编码β-半乳糖苷酶的基因突变
造成其编码的β-半乳糖苷酶
失去正常氨基端一个146个氨基酸的短肽
即α肽链
从而不具有生物活性
即无法作用于X-gal产生蓝色物质
用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为
lacz'的基因
lacz'基因它包括
一段β-半乳糖苷酶的启动子
编码α肽链的区段
一个多克隆位点
虽然上述缺陷株基因组
无法单独的编码有活性的β-半乳糖苷酶
但当菌体中含有带lacz’的质粒后
质粒lacz’基因编码的α肽链
和菌株基因组表达的氨基端
缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补
具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用
X-gal生成蓝色物质的能力
这种现象即α-互补
如图所示多克隆位点位于LacZ’的5’端
它在编码α肽链的区段中
是外源DNA的选择性插入位点
它本身虽不干扰LacZ’基因的合成
但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成
不能与受体菌形成α-互补
操作中添加IPTG
也就是异丙基硫代-β-D-半乳糖苷
它是乳糖的类似物
能诱导乳糖操纵子的启动转录
使受体菌基因组中的lacZ’
的羧基端部分
和载体的lacZ’ a肽都表达
从而互补
实验中通常蓝白筛选
是与抗性筛选一同使用的
含X-gal的平板培养基中
同时含有一种或者
多种载体所携带的抗性相对应的抗生素
这样一次筛选可以判断出
未转化的菌不具有抗性不生长
转化了空载体
即未重组质粒的菌长成蓝色菌落
转化了重组质粒的菌
即目的重组菌长成白色菌落
总之pUC19等载体携带细菌的
乳糖操纵子中的lacZ基因的一部分
它编码β-半乳糖苷酶的
氨基端146个氨基酸
称为α肽
载体转化的宿主细胞为lacZ基因缺失型
它表达β-半乳糖苷酶的羧基端肽链
载体和宿主同时表达两个片段时
宿主细胞才有β-半乳糖苷酶的活性
使特异的底物Xgal在IPTG作用下
变为蓝色化合物
载体在lacZ’基因中靠近5’端
增加一段多克隆位点片段
当多克隆位点插入外源DNA时
会阻断α－肽链的合成
失去α－互补能力
因而不能产生β-半乳糖苷酶
无法分解培养基中的乳糖
生长的菌落就呈白色称为蓝白斑筛选
下边我们看一下本节的第四部分
载体的种类
载体按功能可分为克隆载体和表达载体
克隆载体主要是对目的基因克隆
建立DNA文库和cDNA文库
其上有复制子即可
表达载体是使目的基因在宿主细胞中
表达的一类载体
这类载体既有复制子
更要有强启动子
表达载体又分胞内表达和分泌表达载体
按工作方式可以将载体分为
质粒载体 噬菌体载体
粘粒载体 人工染色体载体等
按受体细胞又可分为
原核细胞载体和真核细胞载体
载体在整个发展过程中
主要分为三个阶段
第一个阶段是在1977年之前
主要就是天然载体
和重组质粒载体的利用
比如像pSC101或者colE1
pBR322等载体
第二阶段是增大载体的容量
就是要降低载体的长度
建立多克隆位点区和新的遗传标记基因
比如像pUC系列的载体
发展到第三阶段主要是以完善载体功能
以满足基因工程克隆中的不同的需求
比如像M13系列载体
含T3 T7启动子的载体
表达型载体及各种探针型载体
总之基因工程随着载体系统的建立而兴起
目的基因能否有效的转入受体细胞
在其中维持和高效表达
很大程度上取决于载体
这里我们要指出的是
基因我们不能申请专利
但是对于新建立的载体
我们是可以申请专利的
好以上就是对载体的一些基本介绍
谢谢大家
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-3.1 蓝白斑筛选-有趣的蓝白斑筛选-根据颜色筛选菌株扥方法
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--4.1 受体细胞
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--4.2 转化
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-5.2 真核表达系统
-5.2 真核表达系统--作业
-6.1 基因工程的应用--工业
--6.1.1 改造后的大肠杆菌生产半胱氨酸-除了用毛发生产半胱氨酸，还可以用大肠杆菌生产半胱氨酸
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-6.2 基因工程的应用--农业
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--6.2.1含有维A的黄金大米--作业
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--6.3.3 基因治疗-交界型大疱性表皮松解症-将一些基因放入大肠杆菌体内，能够表达出更多的蛋白质
--6.3.1基因工程重组疫苗-乙肝疫苗--作业
-- 6.3.2 基因工程药物-赫赛汀--作业
--6.3.3基因治疗-交界型大疱性表皮松解症--作业
-6.4 基因编辑-一种可以治疗疾病的技术
--6.4 基因编辑
-- 阅读下面的参考资料，讨论基因编辑技术在人类医学领域运用的问题。
-6.4 基因编辑--作业
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-基因工程的争论和生物安全--作业
-实验一
--实验一
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-实验二
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-实验三
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-期末考试
-实验四--作业
