5.1 原核表达系统在线视频

同学们大家好

今天我们开始第五章的课程

基因表达系统

克隆基因的最终目的

是为了在宿主细胞中表达

我们在前面的内容中

学习了怎样得到目的基因

把目的基因连到载体

导入宿主细胞

在宿主细胞中表达出目的蛋白

并提取纯化的过程

在这个过程中

宿主既要保持自身的生物活性

又要高效地生产外源基因的蛋白产物

这就有一定的要求

根据宿主细胞的不同

可以分为原核表达系统和真核表达系统

应用最为广泛的是原核表达系统中的

大肠杆菌表达系统

主要有以下几个原因

第一 原核生物是单细胞

生长繁殖迅速

代谢过程易于控制

可以通过发酵快速获得大量的基因表达产物

第二 原核生物基因组结构简单

大多基因组在百万bp数量级

便于基因操作和分析

第三 大多数原核生物含有质粒或噬菌体

可以用来构建相应的表达载体

第四 对于原核生物

尤其是大肠杆菌的生理代谢途径

和基因表达调控机制研究得比较清楚

我们在学习分子生物学的很多内容

都是以大肠杆菌为例的

这一点也更有利于作为宿主表达外源基因

大肠杆菌表达系统

是目前使用最为广泛的原核表达系统

1978年人类胰岛素基因

首次用大肠杆菌得到表达

1979年生长激素基因

1980年人干扰素基因

都是在大肠杆菌中得到表达的

大肠杆菌的基因组不大

已经有2600多次针对大肠杆菌的

全基因组测序

大约有4405个开放阅读框

大肠杆菌的基因克隆表达系统成熟完善

被美国FDA批准为

安全的基因工程受体生物

目前已经商品化的基因工程产品

有很多是由重组大肠杆菌生产的

大肠杆菌表达系统涉及到蛋白质的合成

抑制蛋白产物降解

维持或恢复蛋白特异性的空间构象等

其中增加外源基因的表达量

主要通过控制外源基因的拷贝数

基因转录水平 mRNA翻译速率来控制

这些势必要求表达载体比克隆载体更为复杂

因为这些过程主要有表达载体的

各个元件的精确调控来完成的

这些元件包括启动子及调节基因

终止子 核糖体结合位点 筛选标记

复制子 多克隆位点以及

记忆还要考虑到密码子的偏好

大家还记得启动子是什么吗

原核基因启动子位于基因的上游

长度各不相同

不同的基因启动子序列具有特异性

同时也有保守性

比如-10box -35box

目前常用的大肠杆菌启动子

由乳糖操纵子的启动子

色氨酸操纵子的启动子

此外还有lamda噬菌体的启动子

以及recA基因的启动子等等

这些启动子有强有弱

所以除了使用这些天然的启动子

还可以根据需要

将两种启动子杂合或者串联在一起

以增强外源基因的表达效果

比如Tac启动子

作为表达系统的启动子一般需要是强启动子

我们在讲转录调控的时候

提到过组成型表达和诱导型表达

表达系统一般选用诱导型表达

以达到表达过程可控

避免早期表达产物对宿主的影响

减少细菌蛋白酶对产物的降解

乳糖操纵子在诱导物IPTG的存在下

从受阻遏蛋白阻遏的状态被诱导

产生β半乳糖苷酶

使X-Gal的显示蓝色

就是我们之前讲过的蓝白斑筛选

受lac启动子控制的外源基因的表达

可以被IPTG诱导

需要注意IPTG是具有一定毒性的

不适合医疗食品等目的的重组蛋白

色氨酸操纵子的启动子

比乳糖操纵子的活性强8到10倍

在基因工程中一般使用阻遏蛋白负调控机理

Tac启动子是乳糖操纵子

和色氨酸操纵子启动子的杂合启动子

是非常强的启动子可以被IPTG诱导

过长的转录产物会影响外源基因的表达

工程菌为了不消耗无谓的能量

必须设计合适的终止子来终止转录

一般选择强终止子

也就是发夹结构加上连续的AU对

这样的终止子

甚至可以将多个终止子

串联起来以增强终止作用

外源基因在大肠杆菌中的表达

不仅取决于转录启动频率

还与mRNA的翻译起始效率有关

这就取决于核糖体结合位点

核糖体结合位点对于真核生物基因

在大肠杆菌中的高效表达非常重要

保证核糖体和外源基因的mRNA

有效的形成翻译起始复合物

核糖体结合位点上的SD序列

是mRNA上与核糖体16SrRNA结合的序列

SD序列与核糖体序列的匹配程度

以及与起始密码子之间的距离

决定了翻译起始效率

另外mRNA5‘末端

如果形成了二级结构也会影响翻译效率

因此在构建表达型质粒时

启动子与外源基因之间的核苷酸序列

对翻译的高效性具有重要意义

外源蛋白在大肠杆菌中表达

按照其溶解特性

分为不溶性蛋白和可溶性蛋白

这些蛋白存在以下几种结构形态

包涵体蛋白 分泌型蛋白和融合蛋白

包涵体蛋白质聚集成致密无膜的裸露结构

存在于细胞质或周质中

空间构象不正确

一般没有生物活性

优点在于易于分离纯化

但是不一定能够恢复活性

复性成本高

分泌型表达的异源蛋白一般是通过

分泌或运输的方式定位于细胞周质

甚至穿过外模进入培养基

融合型蛋白是将外源蛋白基因

与受体菌自身蛋白基因重组在一起进行表达

特点是表达率高 稳定性好 易于分离

在大肠杆菌中如何做到目的基因高效表达呢

主要从以下六个方面来考虑

第一 优化启动子和SD序列

根据我们之前讲的

给外源基因配置强启动子和强终止子

优化SD序列和SD序列跟

起始密码子之间的距离

第二 避免使用稀有密码子

使用同义密码子代替稀有密码子

第三 控制质粒的拷贝数

达到拷贝数与宿主生长之间的平衡

第四 保证mRNA的稳定性

第五 保证表达产物的稳定性

如果需要宿主细胞需要蛋白酶缺陷

最后优化发酵工艺

大肠杆菌表达系统既然那么好

我们为什么还要开发其他的表达系统呢

大肠杆菌表达系统也有自身的缺陷

最主要的一点原核生物缺乏真核细胞

特有的加工后处理

只适合于翻译后

不需要进行修饰的真核蛋白

大肠杆菌的表达产物

经常会以包涵体的形式存在

有时会难以恢复活性

大肠杆菌的蛋白酶会降解表达产物

在培养过程中

大肠杆菌还会产生种类繁多的内毒素

一方面影响产品纯度

一方面会引发人体热原反应

好了关于大肠杆菌表达系统就学习到这里

我们下节课见