2.5 反转录PCR及cDNA文库构建在线视频

Hello同学们 我们又见面了

今天我来为大家继续讲解中心法则

大家还记得我们之前讲中心法则

有哪一部分没有讲吗

对了就是信息流的逆向流动部分

从RNA到DNA就是我们本节要讲的反转录

RNA病毒可以以自身的RNA作为模板

指导合成DNA

这一过程是转录的逆反应

因此称为逆转录

逆转录的发现是分子生物学研究

对中心法则的重要修正和补充

1970年科学家在RNA病毒当中

发现了一种特殊的DNA聚合酶

这种酶是RNA依赖性的DNA聚合酶

也就是逆转录酶

逆转录酶以RNA为模板

tRNA为引物

dNTP为底物来合成DNA

跟复制一样

既然体内存在逆转录酶

我们把这些酶在体外进行试验

让它们在体外进行DNA的合成

这一过程我们给它起个差不多的名字

叫反转录

接下来大家了解两种常用的逆转录酶

第一个AMV来自鸟类成髓细胞瘤病毒

最适反应温度是42度

另一个是MMLV

来自鼠白血病病毒莫勒尼株

最适反应温度是37度

逆转录酶的第一个特点是具有

5’到3’的DNA合成能力

第二个特点是这两个酶

都是没有3’到5’的外切活性的

大家还记得这个意味着什么吗

在复制中这个活性我们叫做橡皮擦

DNA合成的方向是5’到3’

一旦发现错了

那么返回去把错误的擦掉重新合成

就是3’到5’的外切活性

但是这两个逆转录酶是没有这个活性的

也就是说

通过反转录合成的DNA

是比较容易出错的

第三个特点是逆转录酶具有RNaseH活性

这个活性针对的是DNA RNA

杂合链当中的RNA

可以水解掉部分RNA

使其变成短片段

合成出来的DNA链我们叫做互补的DNA

也就是cDNA

更具体一点我们叫它cDNA第一链

现在我们得到的产物是这样的

一条cDNA第一链

和一条互补的碎片化的RNA链

DNA聚合酶是必须要有引物才能工作的

刚才我们讲了

逆转录酶在体内所需要的引物是tRNA

那么在体外实验中

我们做的反转录一般用到哪些引物呢

一般情况下我们有三类引物可以选择

第一个叫做随机引物

这个随机引物是六聚体引物

理论上可以结合在模板的任意一个位置上

使用随机引物就意味着

你用作模板的所有RNA

都会被反转录成为cDNA

当然除了3’末端可能不太全

第二种引物叫Oligodt

这个引物里面只有T

为什么会有这样的引物

大家想到什么了吗

对了真核生物mRNA的polyA尾巴

使用Oligodt可以特异性地

扩增真核生物的mRNA

要知道mRNA在总的RNA当中

比例是非常低的

而我们研究基因表达的主要对象

就是功能基因的转录产物mRNA

通过这样的方式就可以对mRNA进行富集

第三种引物就是我们前面讲

PCR反应所用的特异性引物了

在只针对某一个特定基因的实验中

我们就没有必要用随机引物

或者oligodt了

可以直接用特异性引物

那么请大家迅速思考一下

PCR中的两个引物

究竟用哪个来做反转录的引物

答案是Reverse引物

因为引物的是根据正义链

和反义链来定义的

与正义链序列一致的

能够与反义链互补配对的

叫做forward引物

与反义链序列一致

与正义链互补配对的是reverse引物

而正义链则正是mRNA链序列

所以需要reverse引物来与之互补配对

平时关注科研的同学

可能近几年经常会听到转录组这个概念

所谓的转录组

是一门在整体水平上研究细胞中

基因转录的情况以及转录调控规律的学科

是基因功能及结构研究的基础和出发点

是解读基因组功能原件

和揭示细胞及组织分子组成所必需的

转录组研究的是指

特定组织或细胞在某一发育阶段

或功能状态下转录出来的所有RNA的总和

主要包括mRNA和非编码RNA

转录组学研究的主要工具就是RNA-seq

就是RNA测序又称转录组测序

就是把mRNA和非编码RNA全部

或者其中一些用高通量测序技术

进行测序分析的技术

确切地说是针对细胞中

全部或者部分RNA的测序

但是我们现在流行的测序技术都是DNA测序

所以就需要用到我们本节课讲到的反转录

需要把RNA转变成

双链的cDNA再来进行测序

刚才我们已经讲到用RNA作为模板

用逆转录酶合成cDNA第一链的过程了

这个RNA和DNA的杂合链

是不能直接用于DNA测序的

我们需要拿到平末端

也就是两端对齐的

双链的DNA才能用于测序技术

首先我们要在DNA-RNA杂合链当中

加入RNaseH

刚才讲过

逆转录酶也是具有RNaseH活性的

但是我们在很多实际实验中

会觉得这个活性

会影响我们合成的cDNA的完整性

因此有些酶的RNaseH活性

是比较弱或者是没有的

所以我们需要单独再加入RNaseH

使得RNA彻底碎片化

第二步我们要用到一个大家以前学过的酶

大肠杆菌的DNA聚合酶1

还记得这个酶有一个非常重要的作用吗

切口平移

其实就是它的5’到3’的外切

和5’到3’的合成能力

碎片化的RNA可以用来当DNA聚合酶的引物

大肠杆菌DNA聚合酶1

以cDNA第一链为模板

以碎片化的RNA为引物

合成cDNA第二链

合成过程中遇到RNA后

使用切口平移的功能把片段的RNA切除

就好比一个一个的冈崎片段

同时工作的还有DNA连接酶

把各个片段连接起来

最后一步我们用到了T4 DNA聚合酶

这个酶同时具有5'到3'DNA聚合酶活性

和3'到5'DNA外切酶活性

通过T4DNA聚合酶

可以把两端不齐的DNA链补平

5'端突出末端可以补平

3'端突出末端削平

通过这几个步骤

我们就可以把RNA转变成

平末端的双链DNA去进行测序了

通过对测得序列的分析

可以从RNA水平研究基因表达的情况

在做转录组研究的时候

我们还有一个问题需要考虑

大家还记得细胞里面最主要的RNA是什么吗

是核糖体RNA

能占到细胞中总RNA的90%左右

可是对于一个细胞来说

这些RNA的序列几乎都是一样的

因为我们的细胞里面

有好多好多核糖体的拷贝

那我们去分析这些几乎完全一样的序列

是没有太大的意义的

比如当我们通过测序拿到了10g的数据

里面有9G都是重复的序列

是不是就很不好了

而mRNA是功能基因的转录产物

所以在大多数的情况下

我们关注的主要是细胞里面的mRNA

因此需要在测序前对mRNA进行富集

或者说去掉里面的核糖体RNA

对于真核生物比较简单

我们可以在反转录的时候

直接用oligodt引物

就可以只针对含有polyA的mRNA进行实验了

原核生物就要麻烦一些

核糖体RNA和mRNA在序列上

没有什么明显的特征

现在常用的方法是磁珠

我们在磁珠上结合核糖体序列特异性的探针

包括23S 16S和5S核糖体RNA的

不同物种之间的核糖体RNA序列

具有较高的保守性

同时也具有一定的特异性

因此设计出特异的探针是比较容易的

利用磁珠上的探针

与核糖体RNA反转录出的双链cDNA杂交

然后用磁铁把磁珠吸附了

剩下的溶液里面没有结合磁珠的序列

就以mRNA为主了

但是这样的方法并不能保证

去除所有的核糖体RNA

肯定还会有残留

总的来说原核生物的转录组

比真核生物的要麻烦很多

如果去测序公司咨询价格

会发现原核生物的转录组

要比真核的贵5分之一到6分之一

测序结束后

主要进行以下几个步骤的工作

首先将转录组数据

与参考基因组数据进行匹配

就是mapping计算每个基因的表达量

一般以RPKM值来表示

RPKM是将map到基因的read数

除以map到基因组上的所有read数

以million为单位

再除以RNA的长度

这里RNA的长度是以KB为单位

根据各个基因的RPKM值

计算特定组织或细胞

在不同发育阶段或功能状态下

转录出来基因表达差异

但是值得注意的是

转录组分析关注的是mRNA

大家已经知道

一个基因表达出mRNA

未必就一定能得到相应的蛋白质产物

这个mRNA是不是得到了正确的转录后加工

翻译是不是能够正确起始

合成的多肽链能不能正确加工

成为有活性的蛋白质

哪一个步骤出了问题

都会导致没有产生正确的产物

尤其是近年来已经有论文表明

转录组数据和蛋白组数据

很多时候并不重合

也引发了人们对于单纯依赖转录组

分析基因表达情况是不是可靠的质疑

好 本节课就讲到这里

我们下节课见