3.2 质粒载体在线视频

大家好

前一次课给大家介绍了

基因工程载体的基本概念及要求

这节课给大家介绍质粒载体

首先我们了解一下什么是质粒

它是独立于染色体以外的

能自主复制的双链闭合环状的DNA分子

存在于细菌 霉菌 蓝藻 酵母等细胞中

我们来看一下质粒的一般特性

第一质粒的分子大小

一般在1到200个kb左右

第二质粒DNA能够自主复制

是独立复制的复制子

按照质粒复制调控和拷贝数可以分为两类

严紧控制型

其复制与宿主的繁殖偶联拷贝数较少

每个细胞中只有一个到十几个拷贝

松弛控制型其复制与宿主不偶联

每个细胞中有几十到几百个拷贝

第三质粒有不亲和性

它是指在没有选择压力的情况下

两种亲缘关系密切的不同质粒

不能共存于同一宿主细胞内

在细胞增殖过程中有一种会被逐渐排斥掉

这样的两种质粒称为不亲和质粒

第四质粒具有转移性

在自然条件下

许多质粒可以通过细菌接合的作用

转移到新的宿主细胞内

它需具有移动基因 转移基因

顺式作用元件bom

及其内部的转移缺口位点nic

而作为质粒载体所须的基本条件有

第一具有复制

起始点

第二具有选择性标记基因

其理想的载体应该有两种选择性标记基因

第三若干限制性内切酶的单一位点

用来插入外源DNA片断

且插入后不影响复制功能

第四具有较小的分子量和较高的拷贝数

质粒又是如何命名的呢

质粒的命名原则我们以pBR322为例

p代表质粒

BR代表构建该质粒的研究人员姓名

或者是研究的机构名称

322代表一系列的质粒编号

这里要指出p代表质粒的时候需要小写

而BR作为

构建该质粒研究人员的姓名

或者机构名称的时候需要大写

在大肠杆菌中的质粒可以分为

接合型质粒就是能够自我转移的质粒

以及非接合型质粒

这种质粒是不能够自我转移的

接合型质粒 又叫自我转移型质粒

除了带有自我复制所必需的遗传信息外

还带有一套控制细菌配对

和质粒接合转移的基因

比如F质粒

甚至能使寄主染色体上的基因

随其一道转移到

原先不存在该质粒的受体菌中

这种呢是不符合基因工程安全要求的

需要对其进行改造

第二非接合型质粒

虽然带有自我复制所必需的信息

但是失去了控制细菌配对

和质粒接合转移的基因

因此不能从一个细胞转移到另一个细胞

它符合基因工程的安全要求

比如R型质粒就是我们说的抗性质粒

下边给大家介绍一下重要的质粒载体

首先我们来看一下天然质粒的一个局限性

天然存在的野生型质粒由于分子量大

拷贝数低 单一酶切位点少

遗传标记不理想等缺陷

不能满足克隆载体的要求

因此往往需要以多种野生型质粒

为基础进行人工构建

目前实验室使用的大肠杆菌质粒

大多是由少数几个

少数野生型质粒构建而来的

第一就是pSC101

它是第一个用于基因克隆的天然质粒

有5个拷贝

它的分子长9.1个kb

但只有一个EcoR I的

内切酶位点充当克隆位点

抗四环素作为筛选标记

对于这个质粒它具有分子量大 拷贝数低

第二个常用的作为母本的质粒是

Col E1它的分子长度大约是6.5个kb

拷贝数在20到30之间

ColE1质粒的筛选标志是

大肠杆菌素E1

大肠杆菌素E1能够杀死

不含ColE1 质粒的

菌株形成“噬菌斑”

它存在一个问题就是

唯一的克隆位点 EcoR I

正好位于这个基因的内部

也就是我们说的筛选标记不理想

插入外源DNA会导致E1的失活

使受体菌不能合成大肠杆菌素E1

通过以上的质粒我们可以构建出一系列的

其他的可以用于基因工程

的一些新的质粒

比如pBR322质粒 它有三个亲本

pMB1 pSF2124和pSC101

它的复制起点来源于pMB1系列的

高拷贝型复制起点

抗氨苄青霉素基因来源于pSP2124

抗四环素基因来源于pSC101

pBR322的分子长度大约是4.3个kp

它的选择标记为氨苄青霉素和四环素抗性

总共具有24个克隆位点

其中抗氨苄青霉素基因区有3个

因此使用这3个酶切

会导致抗氨苄青霉素基因失活

抗四环素基因区有7个

而抗四环素基因启动子区有9个

因此使用这9个限制性内切酶

会导致抗四环素基因失活

对于pBR322而言它的优点

第一就是双抗菌素抗性选择性标记

插入失活

分两次先后进行死亡

没有获得载体的寄主细胞

在氨苄青霉素或者四环素的培养基中都死亡

获得载体的寄主细胞在含氨苄青霉素

或四环素的培养基中在其中之一中死亡

它的分子小 克隆能力大

高拷贝数

氯霉素扩增之后

每个细胞可达1000到3000个拷贝

它安全 失去了转移蛋白基因

不能够通过接合转移

但是pBR322它有它相应的的缺点

它保留了转移蛋白的作用位点

能够被其他质粒编码的转移蛋白识别

如果再有F质粒的参与就有可能产生转移

因此对pBR322的改造

很多时候就是针对它所保留的

转移蛋白位点进行删除

而pUC序列

是由加利福尼亚大学的两位科学家

于1978年的时候

在pBR322的基础上改造而成

目前使用较多的是pUC18或者是19

同样我们首先来看一下它的元件来源

它的复制起点来源于pBR322

抗氨苄青霉素基因

来源于pBR322的氨苄青霉素基因

但其上失去了克隆位点

lacZ基因的启动子来源于大肠杆菌

lacZ’基因是大肠杆菌lacZ的a-肽链序列

是LacZ 的氨基端片断

pUC质粒的长度大约是2.7个kb

它有10个连续的单一限制性内切酶位点

位于lacZ’基因的5’端作为多克隆位点

它的选择性标记是氨苄青霉素抗性

和 lacZ’基因的a肽互补

也就是蓝白斑筛选相结合

对它的优点

我们可以看到它的分子量更小

所以它存在的外源基因会更大

第二它的选择方便

Xgal显色

和抗菌素双重的直接选择

第三它的克隆便利

具有多个多克隆位点

是有两个不同粘性末端外源DNA

方便地插入

另外它测序方便

pUC序列的多克隆位点

与M噬菌体载体的多克隆位点完全相同

便于把外源DNA转移到M13载体上测序

对于双子叶植物而言

几乎所有的双子叶植物尤其是

豆科类植物的根部常常会形成根瘤

这是由于植物根部被一种

革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌感染所致

其致瘤特性是由该菌细胞内的

野生型质粒 Ti介导的

Ti质粒

是根癌农杆菌中

引发植物产生肿瘤也就是冠瘿瘤的质粒

故称肿瘤诱导质粒也就是Ti质粒

Ti质粒有4个功能区

T-DNA区 病毒区 Con区 复制子区

在T-DNA区呢包括Ti质粒

进入植物细胞约25个kb的部分

即T-DNA

其左右边界各有一个25 bp的

正向重复序列

称为边界序列

为T-DNA转移和整合所必需的

只要保留T-DNA的边界序列

中间序列被外源DNA片段置换

仍可转移整合到植物基因组中

这是Ti质粒用于遗传转化的理论依据

然后它的病毒区

是位于T-DNA区上游

其表达产物可激活T-DNA的转移

显示致瘤性

Con区它含有

农杆菌之间接合转移有关的基因

可受宿主产生冠瘿碱化

使Ti质粒在细菌间转移

也即接合转移基因编码区

复制起始区

调控Ti质粒自我复制

Ti质粒克隆载体真正用于

植物而非农杆菌

农杆菌只起到中介的一个作用

Ti质粒作为载体主要有两大问题

第一 它太大 无适合的克隆位点

第二 T-DNA的存在

不能使转化细胞再生为完整植株

故不能达到直接选育转基因植物的目的

因此需重新构建

构建Ti质粒克隆载体主要有两种方式

一种是构建取代型质粒

用大肠杆菌质粒克隆载体取代

Ti质粒的全部或部分T-DNA序列而构建

外源基因以同源交换的方式重组

第二是构建中间质粒克隆载体

通过将T-DNA的部分序列

插入大肠杆菌质粒载体而构建

以上就是要给大家介绍的

质粒载体的内容

谢谢大家