当前课程知识点：基因工程 > 第四章 目的基因导入受体细胞 > 4.4 DNA测序技术-检测质粒载体中是否有我们提取到的DNA > 4.4 DNA测序技术
各位同学们大家好
上节课杨老师带领大家学习了
重组子的筛选和鉴定
不管用哪一种鉴定方法
想要最终明确插入片段究竟是什么
我们最好还是看一看序列的组成
这就需要用到DNA测序技术
今天我们就来看一看现在有哪些测序技术吧
首先我们要了解的是我们现在说的测序
绝大多数情况下都指的DNA测序
测定组成DNA分子的ATGC的排列顺序
我们先来了解一下DNA测序技术的历史
DNA测序技术是一项非常年轻的技术
1977年两位化学家报道了
通过化学降解法测定DNA序列
同年Sanger发明了双脱氧链终止法
随后双脱氧法得到了极大的发展
形成了我们所说的一代测序
1985年荧光自动测序技术
将一代测序带入自动化时代
1995年毛细管测序出现
这就是我们现在使用的一代测序了
随后2005 06 07（年）
连续出现了三个测序平台
共同特点是高通量 低成本 短读长
2010年前后又分别出现了三代测序
特点是单分子 纳米孔 长读长
我们前面讲到的基因组学
转录组学发展得如此迅速
与测序技术的发展是密切相关的
接下来我们首先来学习一下
为什么一代测序能够长盛不衰
在那么多新技术的更迭下依然有自己的优势
一代测序又叫双脱氧法 末端终止法
也叫sanger法测序
是用它的发明者的名字命名的
Sanger先生获得了两次诺贝尔奖
历史上只有四位科学家有这个殊荣
其中就有大家熟悉的居里夫人
Sanger的两次诺贝尔奖都与测序有关
第一次是测定氨基酸序列
第二次就是DNA测序方法
我们先来复习一下DNA链的延伸过程
正常的DNA是脱氧核糖核酸
如果在链的末端加入一个双脱氧核糖核酸
就没办法再与下一个核苷酸
形成磷酸二酯键了
所以在一个DNA复制的体系里
把某一个核苷酸比如GTP
除了正常加入GTP以外
再加入双脱氧GTP
就会形成一系列的
以双脱氧鸟苷酸结尾的片段
DNA序列复制到一定程度
每一个胞嘧啶对应的位置
都应该有一个鸟苷酸结尾的片段
然后去跑聚丙烯酰胺凝胶电泳
可以区分一个碱基的差异
就知道每一个位置对应的是什么碱基了
以此类推
将每一个核苷酸都进行一组这样的实验
就能明确整个DNA序列上的碱基组成了
Sanger法操作简便
得到了广泛的应用
在此基础上发展出了荧光自动测序技术
目前 应用最广泛的是美国应用生物系统公司
也就是ABI公司的3730系列自动测序仪
基于毛细管电泳和荧光标记技术
把每一种双脱氧核苷酸
用不同的荧光进行标记
这样刚才讲到的四组反应
就可以放到一个体系里了
再使用“电进样”的方法
把带电的样品分子
加到灌好凝胶的毛细管的负极
给毛细管同直流电 DNA开始电泳
各种不同大小的片段就分开了
用仪器检测记录每个荧光峰值的位置
就能够判断DNA序列的组成了
一代测序每次反应运行时间大约2小时
每次可以得到96条序列
每条序列大约800bp
每条序列的成本大约1美元
合下来每兆序列的成本为1500美元
一代测序通量低 读长长 准确率高
更适合处理单独的基因序列测序
不适合做组学测序
人类基因组计划结束后
科学家开始专注于基因的个体多样性
并尝试用新的方法来解决基因组测序的问题
2005年二代测序技术出现了
当时也叫新一代测序 高通量 短读长
低成本是三个二代测序平台共同的特点
这是三个主流的二代测序平台
按照出现的顺序 读长越来越短
通量越来越高
每个碱基的成本越来越低
不过大家要注意对于测序来说
短读长并不是优点
而是一个非常大的缺点
所以454测序于2016年停产
最下面的solid测序于2013年停产
现在的二代测序平台只剩下了
illumina一家
我们就来简单了解下illumina的测序原理
illumina公司的测序方法叫做solexa
意思就是边合成边测序
主要的步骤是以下几步
第一 拿到200到500bp长的序列片段
可以用超声破碎
也可以是这么长的PCR产物
在这些片段两端加上不同的接头
构建单链的DNA文库
接下来让DNA随机与flowcell表面的
channel上的接头互补配对
以接头上固定的DNA为模板
进行桥式扩增
每个DNA片段
都能在周围形成一簇序列的拷贝
这是为了把信号强度放大到能检测到的程度
最后就是进行测序了
向反应体系中加入DNA聚合酶
接头序列做的引物
带有碱基特异荧光标记的四种特殊dNTP
这些dNTP每次只能添加一个
随后游离的dNTP和DNA聚合酶会被洗脱
再用光学设备检测荧光信号
现在ilumina测序主要有Miseq
Hiseq和X-ten三个系统
其中Miseq测序长度为300bp
经过两个末端测序可以达到600bp
一次反应数据量为10G
每兆数据成本为0.4美元
X-ten测序长度为2乘150bp
一次反应90g数据量
每兆数据成本仅0.01美元
测序技术经过第一代 第二代的发展
读长从一代测序的将近1000bp
降到了二代测序的几百bp
但是通量和速度大幅提升
那么第三代测序的发展思路
在于保持二代测序的速度和通量优势同时
弥补其读长较短的劣势
读长可达10kbp
最主要的应用使基因组学
和真核生物的全长转录学研究
每兆数据大约0.04美元
但是三代测序目前错误率还比较高
需要与二代和一代测序
共同使用来弥补各自的缺陷
好了 本节课就上到这里
大家再见
-1.1 绪论和基本概念-是什么让玫瑰开出了蓝色的花朵-带你初次了解基因工程
-1.1 绪论和基本概念--作业
-1.2 发展历史-基因工程是如何形成的
--1.2 发展历史
-1.2 发展历史--作业
-1.3 分子生物学基础
--1.3.1 分子生物学基础1-为什么人类可以繁殖后代-中心法则的发现
--1.3.2 分子生物学基础2-揭示孩子为什么长得像父母-基因表达
--1.3.3 分子生物学基础3-生物体内的蛋白质的如何形成的-基因表达的翻译和调控
-1.3 分子生物学基础--作业
-2.1 核酸提取-怎样得到生物体内的DNA-核酸提取告诉你真正原因
--2.1 核酸提取
-2.1 核酸提取--作业
-2.2 核酸检测-如何检测我们是否已经得到了DNA
--2.2 核酸检测
-2.2 核酸检测作业
-2.3 PCR原理-使DNA变多的好方法
-2.3 PCR原理--作业
-2.4 PCR影响因素-通过实验将DNA变多
-2.4 PCR影响因素--作业
-2.5反转录PCR及cDNA文库构建
-2.5反转录PCR及cDNA文库构建--作业
-2.6 全基因组扩增及基因组研究
-2.6 全基因组扩增及基因组研究--作业
-2.7 工具酶-基因工程中的剪刀和和胶水-工具酶
--2.7 工具酶
-2.7 工具酶--作业
-3.1 蓝白斑筛选-有趣的蓝白斑筛选-根据颜色筛选菌株扥方法
-3.1 蓝白斑筛选--作业
-3.2 质粒载体-谁来帮助科学家完成转基因技术
--3.2 质粒载体
-3.2 质粒载体--作业
-3.3 病毒载体-将变多的DNA放入质粒载体中，为后期测序做准备
--3.3 病毒载体
-3.3 病毒载体--作业
-4.1 受体细胞-生物体中无私奉献的细胞
--4.1 受体细胞
-4.1 受体细胞--作业
-4.2 转化-将选中的基因导入到细胞中的方式
--4.2 转化
-4.2 转化--作业
-4.3 重组子的筛选和鉴定-对特殊加工过的物质进行筛选和鉴定
-4.3 重组子的筛选和鉴定--作业
-4.4 DNA测序技术-检测质粒载体中是否有我们提取到的DNA
-4.4 DNA测序技术--作业
-5.1 原核表达系统
-5.1 原核表达系统--作业
-5.2 真核表达系统
-5.2 真核表达系统--作业
-6.1 基因工程的应用--工业
--6.1.1 改造后的大肠杆菌生产半胱氨酸-除了用毛发生产半胱氨酸，还可以用大肠杆菌生产半胱氨酸
--6.1.1 改造后的大肠杆菌生产半胱氨酸 --作业
--6.1.2 重组基因技术大量生产维生素C--作业
-6.2 基因工程的应用--农业
--6.2.1 含有维A的黄金大米-为什么我们能够生产出金色的大米？
--6.2.2 苏云金杆菌的bt毒蛋白-教你生产出一种具有抗虫害能力的植物
--6.2.3 转基因植物和除草剂抗性-这是一种能够阻止杂草生长的植物
--6.2.1含有维A的黄金大米--作业
--6.2.2苏云金杆菌和bt毒蛋白--作业
--6.2.3转基因植物和除草剂抗性-作业
-6.3 基因工程的应用--医学
--6.3.2 基因工程药物-赫赛汀-微生物可以为人类生产多种药物
--6.3.3 基因治疗-交界型大疱性表皮松解症-将一些基因放入大肠杆菌体内，能够表达出更多的蛋白质
--6.3.1基因工程重组疫苗-乙肝疫苗--作业
-- 6.3.2 基因工程药物-赫赛汀--作业
--6.3.3基因治疗-交界型大疱性表皮松解症--作业
-6.4 基因编辑-一种可以治疗疾病的技术
--6.4 基因编辑
-- 阅读下面的参考资料，讨论基因编辑技术在人类医学领域运用的问题。
-6.4 基因编辑--作业
-基因工程的争论和生物安全-基因工程是一柄双刃剑
-基因工程的争论和生物安全--作业
-实验一
--实验一
-实验一--作业
-实验二
--实验二
-实验二--作业
-实验三
--实验三
-实验三--作业
-实验四
--实验四
-期末考试
-实验四--作业
