2.3 PCR原理在线视频

基因工程是当今研究生命现象的主要方法

而研究过程中需要大量的核酸样品

为了获取这些核酸样品

可以通过从大量的样品中

分离提取和人工合成方法获得

第一种方法需要耗费大量的生物样品

对一些很珍贵的生物样品来说

变得尤为困难

由此人工合成方法

成为当今基因工程中必要的手段

上世纪60 70年代

人们就致力于基因的体外分离技术

然而由于核酸的含量极少

一定程度上限制了DNA的体外操作

于1971年最早提出 核算时TR

扩增设想

即按照基因序列进行体外合成

该方法是模拟细胞分裂过程中

染色体的复制过程对基因进行复制

以获得足够量的目的基因

那让我们回顾与总结一下

细胞内DNA是如何复制的

DNA体内复制需要以下各项条件

DNA模板即需要复制合成的DNA样品

DNA解旋酶即解开DNA双螺旋的生物酶

引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶缓冲液

DNA合成所必需的四种脱氧核苷酸

1983年美国科学家Kary Mullis

驱车在蜿蜒的高速公路上行驶时

感觉两排路灯就是DNA的两条链

自己的车和对面开来的车

象是DNA聚合酶

面对面地合成DNA

由此萌发了用两个引物

去扩增模板DNA的想法

即PCR的雏形

经过两年的努力

该设想也经过了实验证实

并申请了首个有关PCR的专利

随后在科学等杂志

相继发表代表性论文三篇

并于1993年获得诺贝尔化学奖

现在来小结一下PCR的发展历程

即Khorana等1971年提出

在体外经DNA变性 与适当引物杂交

再用DNA聚合酶延伸

克隆DNA的设想

1983年Mullis发明了PCR技术

Khorana的设想得到实现

但当时用的Klenow酶不耐热

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶

Taq

引入了PCR技术

1988年第一台PCR仪问世

1989年美国《Science》杂志

比喻1989年为PCR爆炸年

Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖

那让我们来了解一下

如何模拟体内复制体系

来构建体外基因扩增的反应体系

即聚合酶链式反应体系

就是我们通常所称的PCR反应体系

标准的PCR反应体系

模拟DNA体内合成条件

由下列部分所组成

10倍扩增缓冲液含镁离子

10微升

4种dNTP混合物各200微摩尔每升

引物上有下有各10到100pmol

模板DNA 0.01至2微克

DNA聚合酶 2.5单位

添加超纯水至100微升

那么我们就会发现一个问题

与体内复制体系相比

上述反应体系里缺少了什么呢

是否缺细胞复制所必需的DNA解旋酶呢

而起初Mullis创建PCR技术

使用的是大肠杆菌

DNA聚合酶I的Klenow片段

而该酶不耐热

每做一个PCR反应需添加一次聚合酶

那么PCR反应能扩增出所需的

特定目的基因的关键是啥呢

其实就是引物primer

PCR产物的特异性

取决于引物与模板DNA互补的程度

理论上只要知道任何一段模板DNA序列

就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物

利用PCR反应

就可将模板DNA在体外进行大量扩增

那让我们了解一下

PCR反应的理论依据与基本原理

DNA半保留复制的机理

体外DNA分子于不同温度下

与不同温度下可变性和复性的性质

通过人为控制体外合成系统的温度

使双链DNA变成单链

单链DNA与人工合成的引物退火

五 DNA聚合酶使引物沿着单链模板

延伸为双链DNA

接着让我们了解一下PCR反应的定义吧

它是依赖于靶序列侧翼上

结合的两个寡核苷酸引物

在体外由DNA聚合酶

催化合成特异性DNA片段的方法

PCR反应主要是在微量离心管中

加入适量的反应缓冲液

微量的模板DNA

四种脱氧核苷酸

耐热性DNA聚合酶

一对合成DNA的引物

通过高温变性 低温退火

和中温延伸三个阶段的循环合成DNA

和中温延伸三个 循环合成DNA

每一次循环使特异区段的基因拷贝数

一般样品经过30至35次循环

可使基因的拷贝数达到数百万

再让我们了解一下PCR的技术特点

该技术速度快 灵敏度高

理论上目的产物的扩增量达230个拷贝

即10的九9次方拷贝

特异性引物的序列

及其与模板结合的特异性

是决定PCR反应结果的关键

引物设计的原则

是最大限度地提高扩增效率和特异性

尽可能减少非特异性扩增

操作简便易行

只需要数小时就可以用电泳法检测出

一微克基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列

不过PCR需要电泳对结果进行检测分析

还可能存在电泳点样时

因样品满溢而造成假阳性结果

并且不能对PCR过程中的扩增子进行监测

用途广泛生命学科 医学工程 遗传工程

疾病诊断 法医学 考古学

PCR根据其操作原理

主要有以下各种PCR

长而精确PCR 热启动PCR

反向PCR 锚定PCR

cDNA末端的快速扩增

即RACE PCER

逆转录PCR 连接酶链反应PCR

Bubble-PCR

实时荧光定量PCR

不但为了能对靶基因进行定性

而且能更为精确定量

美国Applied Biosystems公司

即ABR公司

于1996年首先推出实时荧光定量PCR仪

该技术主要是在PCR反应体系中

加入荧光基团

利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程

最后通过标准曲线

对未知模板进行定量分析的方法

实时荧光定量PCR是有其数学依据

该PCR的反应方程式如下

n循环后的目的模板DNA的含量

等于初始目的模板DNA浓度

该方程只在指数期时成立

典型的PCR由基线期 指数增长期

线性增长期与平台期组成

那么让我们了解一下普通PCR

与实时荧光定量PCR的异同

PCR是对PCR扩增反应的终点产物

中点产物定量和定性分析

而无法对起始模板准确定量

无法对扩增反应实时检测

而Real-time PCR是利用荧光信号的变化

实时检测PCR扩增反应中

每一个循环扩增产物量的变化

通过Ct值和标准曲线的分析

对起始模板进行定量分析

那么来了解一下

Real-time PCR的扩增曲线图

扩增曲线的横坐标是扩增循环数

纵坐标是荧光强度

每个循环进行一次荧光信号的收集

荧光信号阈值 threshold

是前15个循环信号作为

荧光本底信号（baseline）

即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值

荧光域值设置为3至15个循环的

荧光信号的标准偏差的10倍

一般手动设置的原则是

要大于样本的荧光背景值

和阴性对照的荧光最高值

同时要尽量选择进入指数期的最初阶段

并且保证回归系数大于0.99

而真正的信号是荧光信号超过域值

Ct值定义为PCR扩增过程中

扩增产物的荧光信号

达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数

模板DNA量越多

荧光达到阈值的循环数越少

即Ct值越小

Log浓度与循环数呈线性关系

通过已知起始拷贝数的标准品

可作出标准曲线

根据样品Ct值

就可以计算出样品中所含的模板量

即起始模板DNA量

实时荧光定量PCR

分为非特异性荧光标记

与特异性荧光标记两类

非特异性荧光标记即荧光染料法

是DNA结合染料与DNA双链结合时

在激发荧光源的照射下发出荧光信号

其信号强度代表双链DNA分子的数量

而特异性荧光标记即荧光探针

又有TaqMan探针 TaqMan MGB探针

分子信标等

YBR GREEN I能与DNA双链的小沟

特异性地结合

其荧光信号强度

也随着结合DNA的增加而增强

由此随着PCR扩增产物的增加

其荧光强度也就随之增强

SYBR GREEN I的优势首先在于

使用方便 成本低

其次对DNA模板无选择性

故适合初步筛选

再则可用熔解曲线判断PCR

有无杂带与引物二聚体

但是该方法存在模板特异性低

不能多重检测与灵敏度低等短处

该方法可用于起始DNA浓度的测定

基因型的分析及根据熔解曲线

而优化PCR条件

TaqMan探针与TaqMan MGB探针的原理

是利用Taq酶的5’外切酶活性

该酶能裂解DNA5’端的核苷酸

从而释放出单个寡核苷酸

基于Taq酶的该生化特性

依据目的基因合成一个

能够与之特异性杂交的探针

该探针的5’端标记报告基团

荧光基团

3’端标记淬灭基团

正常情况下

这两个基团的空间距离很近

构成荧光共振能量转移关系

荧光基团因淬灭基团而不能发出荧光

随着PCR扩增

引物与特异性探针同时结合至模板

探针结合的位置位于上下游引物间

当扩增延伸至探针结合的部位时

Taq酶利用5’外切酶活性

将探针5’端连接的荧光分子切下

从而破坏了两个基团间的FRET

由此发出荧光

切割的荧光分子数

与PCR产物的数量成正比

由此可以根据PCR反应体系中的荧光强度

即可计算出初始DNA模板浓度

探针法可用于起始模板DNA浓度的测定

基因型分析

目的基因的定性与定量

反应产物的鉴定

等位基因的鉴定

本节课就到这里

谢谢大家