2.4 PCR影响因素在线视频

现在让我们再回顾一下

上节课所讲解的PCR的反应流程

与基本体系

DNA首先在90至95摄氏度变性1到2分钟

随后迅速冷却至40到60摄氏度

引物退火并结合至靶序列上

时间大约为1分30秒

再快速升温至70至72摄氏度

在DNA聚合酶Taq酶的作用下

使引物链模板延伸复制DNA

反应时间以目的基因长度为依据

一般500碱基的反应时间为30秒

按此流程实施30至35个循环

反应体系里需要模板DNA或RNA

反应缓冲液

引物 耐热的DNA聚合酶 镁离子

4种核苷酸

让我们先了解一下PCR反应的主要参与者

引物的相关基础知识

引物是与待扩增的目的DNA两端序列

互补的人工合成的寡聚核苷酸片段

一般它的长度为15到30

由DNA聚合酶决定

分为Forward primer

reverse primer

引物决定目的基因的扩增长度

一般2k以下的碱基对容易扩增

每条引物的浓度为0.1至0.5微摩

引物会涉及Tm值即解链温度

和Ta即退火温度

那么来了解一下引物涉及的原则

首先了解一下基本原则

引物应最大程度地提高扩增效率和特异性

同时尽可能抑制非特异性扩增

引物长度一般为15至30bp

常用20bp左右

引物的有效长度不能大于38bp

否则最适延伸温度会超过

Taq DNA聚合酶的最适温度74摄氏度

不能保证PCR扩增产物的特异性

其次引物扩增跨度因为500bp为宜

特定条件下

可将目的基因扩增片段增至10kb

引物碱基的G+C含量以40%至60%为宜

G+C含量太少则扩增效果不佳

而G+C含量 过多则易出现非特异条带

ATGC最好随机分布

避免5个以上的嘌呤

或嘧啶核苷酸的成串排列

尤其3′端不应超过3 个连续的G或C

因为这样会使引物在G+C富集区

引发错误延伸

避免引物内部出现二级结构和引物间互补

尤其须避免 3’端的互补

否则会形成引物二聚体

产生非特异性的扩增条带

五 引物 3’端的碱基要求严格配对

不能做任何修饰

特别是最末及倒数第二个碱基

以避免因末端

碱基不配对而导致PCR失败

引物5′端可修饰 引物5′端

限定着PCR产物的长度

但对扩增特异性影响不大

引物5′端碱基可不与模板DNA互补

而呈游离状态

引物5′端最多可加10个碱基

而对PCR反应无影响

七 引物的特异性

引物应与核酸序列数据库的其它序列

无明显同源性

引物量

每条引物的浓度为0.1到0.5微摩

以最低引物量产生所需要的结果为好

引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增

且可增加引物之间形成二聚体的机会

为了更好覆盖

与扩增不同生物的相同目的基因

就会在引物设计时引入简并引物

不过简并碱基过多

会影响PCR反应体系及特异性扩增

再则来了解一下PCR反应的重要工具

DNA聚合酶的相关知识

目前主要有两类DNA聚合酶供应

天然酶从热泉嗜热杆菌中提纯即Taq酶

基因工程酶由大肠杆菌合成而得

一个典型的PCR反应约需酶量

1到2.5单位没100微升体系

浓度过高可引起非特异性扩增

浓度过低则合成产物量减少

现在了解一下在应用的主要DNA聚合酶

Klenow片段 T4 DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶

该酶应用最广

其他DNA聚合酶有

Tth DNA聚合酶 Vent DNA聚合酶

Pfu DNA聚合酶等

那么让我们了解一下Taq DNA聚合酶

的生化性质

它的最适反应温度为75到80摄氏度

最适反应条件为1.5毫摩 氯化镁

50到55毫摩 氯化钾 PH7.8到9.0

其延伸速率dNTP每秒每个酶分子

75摄氏度为150bp

70摄氏度小于60bp

55度为 24bp

37摄氏度为1.25bp

22摄氏度为0.25bp

酶的半衰期

97.5摄氏度为5到6分钟

95摄氏度为40分钟

92.5摄氏度为130分钟

错误率为8.9乘以10的负5次方

至1.1乘10的负4次方

需要引物

热启动PCR优化目标扩增产物

抑制非特异扩增

Taq酶的保真性不高

5’至3’聚合酶活性

和5’至3’外切酶活性

无3’至5’外切酶活性

在PCR反应中如发生某些碱基的错配

该酶是没有校正功能

保真性不如Pfu DNA聚合酶等

再让我们了解一下

脱氧核苷酸的质量与浓度吧

在PCR反应中

dNTP应为50至200微摩

浓度过低会降低PCR产物的产量

注意4种dNTP的浓度要相等

等摩尔配制

如其中任何一种浓度不同于其它几种时

偏高或偏低

就会引起错配

高浓度的dNTP可与镁离子结合

使游离的镁离子浓度下降

影响DNA聚合酶的活性

让我们了解一下模板DNA的相关知识

首先了解一下模板DNA的来源

微生物中提取DNA

从细胞中提取DNA

包括血细胞 绒毛 尿样 毛发 精斑

口腔上皮细胞

固定和包埋的组织标本

脱蜡 蛋白酶K消化

模板DNA的浓度一般需要

0.1至2微克每100微升体系

PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高

不过模板DNA浓度过高

也会导致非特异性产物增加

再让我们了解一下

PCR反应中镁离子的浓度

及其对反应的影响

镁离子对PCR扩增的特异性

和产物的浓度有显著影响

在一般的PCR反应中

各种dNTP浓度为200 微摩每升时

镁离子浓度为1.5至2.0毫摩每升为宜

镁离子浓度过高

则反应特异性降低

出现非特异扩增

浓度过低又会降低 Taq DNA聚合酶的活性

使反应产物减少

让我们了解一下

如何设置PCR反应的温度与时间

首先要了解PCR反应中的三个温度点

即变性 退火和延伸

通常标准PCR反应中采用三温度点法

即双链DNA在90至95摄氏度变性

再迅速冷却至40至60摄氏度退火

然后快速升温至70至75摄氏度延伸

对于较短的目的基因

长度100至300bp

也可采用二温度点法

将退火与延伸温度合二为一

一般采用94摄氏度变性

65摄氏度左右退火与延伸

通过高温变性 低温退火与适当温延伸

并通过30到35循环

目的基因片段即可扩增100万倍以上

九 一般将变性温度与时间分别设定为

94至95摄氏度与1分钟

该设定足以使模板DNA变性

若低于93摄氏度则需延长时间

但温度不能过高

因为高温环境对DNA聚合酶的活性有影响

退火温度是影响PCR特异性的重要因素

并且退火温度与时间

取决于引物的长度 碱基组成及其浓度

还有靶基因序列的长度

对于20个核苷酸

GC含量约为50%的引物

将55摄氏度作为

最适退火温度的设定起点较为理想

引物的复性温度还通过下述公式计算

推测并选择合适的温度

Tm值即解链温度等于

4乘以G加C括弧

加2乘以括弧A加T)

而复性温度等于Tm值

减去5到10摄氏度

在Tm值允许范围内

选择较高的复性温度

可大大减少引物和模板间的非特异性结合

提高PCR反应的特异性

复性时间一般为30至60秒

足以使引物与模板之间完全结合

再让我们了解一下PCR的重要步骤

即延伸温度与时间的设定

先了解一下Taq DNA聚合酶的生物学活性

该酶在70到80摄氏度

150核苷酸每秒每酶分子

在70摄氏度延伸60核苷酸每秒每酶分子

55摄氏度 24核苷酸每秒每酶分子

高于90摄氏度时

DNA合成几乎不能进行

一般将延伸温度设定为70至75摄氏度

常用温度为72摄氏度

过高的延伸温度不利于引物和模板的结合

延伸反应时间

则是根据待扩增片段长度而定

一般1Kb以内的DNA片段

延伸时间为1分钟足矣

而3至4kb的靶序列则需3到4分钟

当扩增片段长至10kb时

就需要将延伸延长至15分钟

延伸时间过长会导致非特异性扩增

对低浓度模板的扩增

则需稍微延长延伸时间

循环次数决定了PCR扩增程度

而循环次数又主要取决于模板DNA的浓度

一般循环次数设定为30到40次之间

不过循环次数越多

非特异性扩增产物的量亦随之增多

本节课就到这里

谢谢大家