当前课程知识点：临床科研实验技能 >  第三章 分子生物学常用实验技术 >  3.4 蛋白质印迹技术 >  3.4.4 蛋白质印迹常见问题分析

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3.4.4 蛋白质印迹常见问题分析在线视频

下一节:第三章 课件

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3.4.4 蛋白质印迹常见问题分析课程教案、知识点、字幕

同学们好

今天我给大家介绍的这个知识点是

蛋白质印迹常见问题分析

蛋白质印迹常见问题包括内参选择

无信号或弱信号 背景较高 多带现象

首先我们看内参选择

管家基因编码多种组织

和细胞中稳定表达的蛋白

用于检测整个WB实验过程

及体系是否正常工作

并作为半定量检测目的

蛋白表达量的标准对照

内参选择

1. 样本种属来源

哺乳动物组织或细胞来源样本

一般选择GAPDH β-actin α-tubulin等

植物来源的样本

一般选择plant actin Rubisco等

其它研究较少样本

一般参照相应文献的报导

选择合适的蛋白质作为内参

2. 目的蛋白分子量应保证目的蛋白

与内参蛋白分子量相差5 KDa以上

以防检测时干扰

如目的蛋白分子量为45 KDa

不宜选β-actin（42 KDa）作内参

可考虑选GAPDH（36 KDa）

或β-tubulin（55 KDa）作内参

3. 目的蛋白表达部位

常用的核内参抗体有Lamin A Lamin B等

膜蛋白检测常用的内参抗体为Na+/K+-ATPase

线粒体蛋白检测常用VDAC1等作内参抗体

蛋白质印迹如果出现无信号或信号弱

可能是因为检测样本不表达

或低表达目的蛋白

选择表达量高的细胞作为阳性对照

转膜不完全或过度

分子量太大或太小的蛋白应增加

或缩短转膜时间

一抗与二抗不匹配或不能识别抗原

则选择对一抗来源的种属抗体

或认真阅读说明书

确定其能否识别目的蛋白种属抗原

二抗受叠氮钠抑制

则避免使用叠氮钠

和HRP标记抗体一起使用

背景较高是可能因为

未进行非特异性封闭或封闭不充分

解决办法是延长封闭时间

考虑更换合适的封闭剂

也有可能是一抗浓度过高

则稀释抗体至合适浓度

以更高稀释度抗体孵育更长时间

也可能是膜干燥

孵育过程中任何步骤

都保证膜有充分的反应液

避免出现干膜现象

如果是曝光时间过长引起

则适当缩短曝光时间

如出现多带现象

可能是因为目的蛋白

有多个剪切体或修饰位点

如泛素化 乙酰化和糖基化等

这个我们需要查阅文献

和生物信息学分析其可能性

也有可能多带

是由于蛋白质发生降解引起

样品裂解过程中加入蛋白酶抑制剂

和避免蛋白样品反复冻融

多带也有可能是一抗特异性不好

则选择特异性强的

单克隆抗体代替多克隆抗体

多带如果是由于一抗

或二抗浓度偏高引起

就降低抗体浓度或孵育时间

我们应注意实验安全

即实验操作时要戴手套 口罩

操作有毒或挥发试剂时

则带口罩并且在通风橱中进行

废弃物要严格按照实验室废弃物处理

和管制制度执行

这个知识点就介绍到这里

谢谢大家！

临床科研实验技能课程列表：

第一章 临床科研实验实施与总结

-1.1 临床科研实验简介

--1.1 临床科研实验简介

-1.2 医学实验中心基本情况

--1.2 医学实验中心基本情况

-1.3 进室流程和管理制度

--1.3 进室流程和管理制度

-1.4 实验总结要点和实验心得

--1.4 实验总结要点和实验心得

-第1章 习题作业

--第1章 习题作业

-第一章 课件

--第一章 课件

第二章 临床科研诚信与学术规范

-2.1 科研诚信问题

--2.1 科研诚信问题

-2.2 科研诚信与学术规范

--2.2 科研诚信与学术规范

-2.3 杜绝科研不端行为

--2.3 杜绝科研不端行为

-第2章 习题作业

--第2章 习题作业

-第二章 课件

--第二章 课件

第三章 分子生物学常用实验技术

-3.1 分子生物学常用实验技术

--3.1 分子生物学常用实验技术

-3.2 PCR技术

--3.2.1 PCR技术概述

--3.2.2 PCR实验流程

--3.2.3 PCR实验操作

--3.2.4 PCR技术类型及应用

-3.3 电泳技术

--3.3.1 电泳技术概述

--3.3.2 常用电泳方法

--3.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作

-3.4 蛋白质印迹技术

--3.4.1 蛋白质印迹概述

--3.4.2 蛋白质印迹实验流程

--3.4.3 蛋白质印迹实验

--3.4.4 蛋白质印迹常见问题分析

-第3章 习题作业

--第3章 习题作业

-第三章 课件

--第三章 课件

第四章 精准医学与遗传病

-4.1 精准医学概述

--4.1 精准医学概述

-4.2 常见遗传病简介

--4.2 常见遗传病简介

-4.3 精准医学在遗传病中的应用

--4.3 精准医学在遗传病中的应用

-第4章 习题作业

--第4章 习题作业

-第四章 课件

--第四章 课件

第五章 临床科研中常用数据库和软件使用

-5.1 生物信息学概述

--5.1 生物信息学概述

-5.2 常用生物信息学数据库

--5.2 常用生物信息学数据库

-5.3 常用生物信息学分析工具

--5.3 常用生物信息学分析工具

-5.4 常用数据库和软件使用

--5.4.1 序列查询

--5.4.2 序列比对

--5.4.3 UniProt

--5.4.4 文献检索

--5.4.5 变异查询

--5.4.6 OMIM

--5.4.7 变异解读

--5.4.8 变异预测

-第5章 习题作业

--第5章 习题作业

-第五章 课件

--第五章 课件

第六章 细胞培养技术

-6.1 细胞培养基本概念

--6.1 细胞培养基本概念

-6.2 细胞培养基本条件

--6.2 细胞培养基本条件

-6.3 细胞培养基本方法

--6.3 细胞培养基本方法

-6.4 细胞培养操作流程

--6.4 细胞培养操作流程

-6.5 细胞冻存、复苏和污染检测

--6.5 细胞冻存、复苏和污染检测

-第6章 习题作业

--第6章 习题作业

-第六章 课件

--第六章 课件

第七章 细胞凋亡

-7.1 细胞凋亡概述

--7.1 细胞凋亡概述

-7.2 细胞凋亡分子机制

--7.2 细胞凋亡分子机制

-7.3 细胞凋亡的检测

--7.3 细胞凋亡的检测

-7.4 细胞凋亡与疾病

--7.4 细胞凋亡与疾病

-第7章 习题作业

--第7章 习题作业

-第七章 课件

--第七章 课件

第八章 动物实验技术

-8.1 动物实验设计与应用

--8.1 动物实验设计与应用

-8.2 实验动物分类与选择

--8.2.1 实验动物分类与选择

--8.2.2 动物实验基本操作

-8.3 医学动物实验模型

--8.3 医学动物实验模型

-8.4 实验动物的伦理与福利

--8.4 实验动物的伦理与福利

-第8章 习题作业

--第8章 习题作业

-第八章 课件

--第八章 课件

第九章 免疫学实验技术

-9.1 免疫组化技术

--9.1 免疫组化技术

-9.2 免疫荧光技术

--9.2 免疫荧光技术

-9.3 酶联免疫吸附技术

--9.3 酶联免疫吸附技术

-第9章 习题作业

--第9章 习题作业

-第九章 课件

--第九章 课件

第十章 SCI论文写作与发表

-10.1 SCI论文基本知识

--10.1 SCI论文基本知识

-10.2 SCI论文写作

--10.2 SCI论文写作

-10.3 SCI论文撰写技巧

--10.3 SCI论文撰写技巧

-10.4 SCI论文投稿和发表

--10.4 SCI论文投稿和发表

-第10章 习题作业

--第10章 习题作业

-第十章 课件

--第十章 课件

3.4.4 蛋白质印迹常见问题分析笔记与讨论

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