6.4 细胞培养操作流程在线视频

欢迎了解细胞培养

我们先来介绍细胞培养原理

细胞在培养瓶长成致密单层后

已达到饱和状态而出现生长抑制

为使细胞能继续生长

同时也将细胞数量扩大

须进行传代再培养

传代培养是一种将细胞种保存延续的方法

同时也是利用培养细胞进行

各种实验的必经过程

悬浮型细胞直接分瓶就可以

而贴壁细胞需经消化后才能分瓶

下面我们具体来介绍细胞培养前的

准备与操作方法

在一更处换鞋

进入二更

戴口罩 帽子

穿好隔离服

进入三更

清洗双手

按6步法清洗

可去除手上的细菌

然后进入细胞培养间

进入培养间后

戴上手套

衣服套入手套中

打开生物安全柜电源

玻璃门所打开的高度有一定限制

在刻度指示处

先用75%酒精喷洒生物安全柜台面

然后用无菌纱布擦拭生物安全柜

摆放所需要的物品

摆放的物品也需要用75%酒精喷洒或擦拭

不能擦拭的则提前放入以待紫外照射消毒

所需要物品如下

多用试管架 记号笔 镊子 无菌吸管

无菌培养瓶以及废液缸

废液缸可选择高温灭菌

或无法灭菌时需要提前用84浸泡30分钟

然后用75%酒精喷洒和紫外照射

你也可以使用负压抽吸系统替代废液缸

准备好物品后关上生物安全柜门

紫外照射30分钟

所需要操作的区域禁止被物品遮挡

以上完成后我们准备所需要使用的试剂

培养基 胎牛血清

0.25%胰蛋白酶含0.02%EDTA

磷酸缓冲盐溶液(PBS)

以上试剂提前从冰箱中拿出

放在室温复温或37度水浴中复温

拿出的培养试剂防止紫外照射

以免因为光照导致L-谷氨酰胺降解

以及胰蛋白酶丧失活性

另外

我们所需要配备的仪器设备

二氧化碳培养箱

水平离心机

倒置显微镜

工作台照射30分钟后可以开始实验

1.实验前用75％酒精消毒所需要的试剂

2.从培养箱中拿出所培养的细胞

在显微镜下观察细胞生长情况

3.取对数生长期的细胞进行传代

消毒培养瓶后拿入工作台

用巴氏吸管弃去旧的培养基

加入PBS 6毫升

轻轻吹打后将PBS吸弃

重复此动作2次

或用负压装置来吸弃旧培养基

4.打开0.25%胰蛋白酶盖子

用巴氏吸管吸取适量胰蛋白酶（约1 mL）

加入的量以培养细胞消化难易程度为准

轻轻摇动让胰蛋白酶铺满瓶底后弃掉

放入培养箱2 min

然后迅速拿出

显微镜下观察细胞消化情况

5.当细胞质回缩

胞间间隙变大后终止消化

取含10%血清的DMEM培养基8 ml加入

反复轻轻吹打培养瓶壁

制备细胞悬液

当所有细胞均从培养瓶底部脱落下来

且成片的细胞已经分散成小的细胞团

或单细胞时便可停止吹打

6.打开新培养瓶

按1:2分瓶后盖好培养瓶盖

作好标记

继续放入二氧化碳培养箱中培养

7.实验完毕

把培养基及其他物品盖好

拿出所有物品后

用75%酒精纱布擦拭台面

关上生物安全柜门

注意事项

1.在工作台面消毒时切勿将培养细胞

和培养用液同时照射紫外线

消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置

否则会遮挡射线降低消毒效果

2.对数生长期

一般将微生物生长典型曲线分为

延滞期 对数期 稳定期和衰亡期四个时期

对数生长期又叫指数生长期

是指微生物细胞经过延迟期的调整后

细胞数以几何级数增加

3.胰蛋白酶消化时间长短是实验成败的关键

宁可短消化 不能过消化

否则细胞膜受损

而无法贴壁从而导致细胞死亡

4.及时在倒置显微镜下观察

当细胞质回缩

胞间间隙变大为消化适宜

这个度的把握以培养细胞不同而有所不同

在培养中总结经验

5.吹打细胞时用力不要过猛

尽量不要出现气泡

以免影响细胞生长